叶片叠加导致荧光产量增加的原因分析

黄语琦

研究背景

叶绿素色素分子未激发时处于能量的最低状态——基态。色素分子吸收1个光子后，会引起原子结构内电子的重新排列。其中一个低能的电子获得能量后就可克服原子核正电荷对其的吸引力而被推进到高能的激发态。激发态的叶绿素分子回至基态时，能够以光子形式释放能量。处在激发态（第一单线态）的叶绿素分子回至基态时发出的光称为荧光（fluorescence）。叶绿素荧光是研究光合作用光反应中光能吸收、捕获、利用和分配极为重要的工具。其在抗逆研究、品种评价和筛选、环境评价等方面起着重要作用。

近期，有台湾学者认为目前对于叶绿素荧光的测定和分析方法忽略了叶片的复杂结构，这种方法存在一定缺陷。他们认为他们的实验结果证明了激发光能够到达第2层叶片，并以弱光的形式激发下层叶片的荧光。而且，他们还初步证明J-I这一段荧光产量的增加很可能与深层细胞激发的荧光有关。

研究过程

叶片叠加后荧光产量的增加是否完全由第2个叶片受激发而产生？荧光产量增加的原因究竟是什么？此外，激发光强度是否影响对荧光结果的分析？本实验对以上问题进行了探究，用叶片叠加的方法进行荧光产量的测定，目的是验证台湾学者叶片叠加方法的可行性与效果，并提出改进思路，探究荧光产量增加的可能原因。

叶片叠加后荧光产量增加的验证

本次实验选择了成熟新鲜的元宝枫叶片作为实验材料（见图1）。设定激发光光强梯度为由弱光到强光200～3 000umol ms，每200umol ms一个激发光梯度。从实验数据中可观察到，叶片叠加的确可以导致测得的Fn、FJ、F1、FP荧光产量均增加；激发光较弱时增加幅度小，伴随激发光的增强，各特征点荧光产量也迅速增加。与之前台湾学者的实验结果相符。

激发光穿透叶片后的强度测定

为了研究叶片叠加后荧光产量的增加是否与第2层叶片中叶绿素的激发有关，本实验测量了激发光在透过第1层叶片且被其中叶绿素吸收后的强度。光强使用光量子计测定。从实验数据看出，激发光在穿过第1层叶片被其中叶绿素吸收后，光强大大减弱，比本实验中最低激发光200 umolm s还要小。因此透射光激发的第2层叶片的荧光对荧光产量贡献很小。

平面镜模拟叶片对荧光反射的研究

倘若穿过第1层叶片后的激发光强度不足以激发第2层叶片，那么叶片叠加后荧光产量增加的原因是什么？我推测，这可能与叶片上表面的蜡质对荧光的反射作用有关。叶片的角质层常分2层，其中细胞壁外面是一层较薄的、由角质或角质与蜡质混合组成的角质层。

蜡质的存在导致了上层叶片被激发光激发的荧光向四面传递，一部分到达下层叶片被下层叶表面的蜡质反射上去。最终被叶片上方的荧光探头接收到，导致了测得的荧光产量增加，见图2。

为了继续研究叶片叠加后荧光产量增加的原因，验证下层叶片的反射是否会导致测得的荧光产量增加，实验中选用了平面镜作为实验材料。平面镜对荧光有很好的反射作用，且不会产生新的荧光，可以用来替代下层叶片研究荧光的反射。

实验材料分成3个实验组，分别为单层叶片、单层叶片叠加平面镜、双层叶片叠加。测量单層叶片叠加平面镜时，将平面镜叠加在元宝枫叶片的下层，和叠加2层叶片的方法相同，用叶绿素荧光测试仪在叶片上方测量荧光产量。

实验测得单层、单层叠加叶片、双层3组的O、J、I、P 4个荧光特征点的荧光产量，其中F0实验结果如图3所示。将叠加叶片与叠加平面镜后荧光产量的增长率相减，能大致得出排除叶表反射后，第2层叶片真实激发的荧光比例。

由数据可以看出，在叶片下层叠加平面镜后的确使测得的荧光产量增加了。这证明反射作用能使荧光产量增加。这一部分荧光产量的增加是来自于叶表面的蜡质/角质层的反射所致。

我们的结果也证明2层叶片叠加的荧光产量大于1层叶片叠加平面镜的荧光产量。单独叠加平面镜，各特征点F0、FI、FJ、FP荧光产量增加均在10%以下，叠加叶片荧光产量的增加则在20%左右。说明叶片叠加条件下荧光产量的增加与第2层叶片叶表的荧光反射和叶绿素的激发均有关。根据实验数据中叠加叶片与叠加平面镜后荧光产量的增长率差，能大致得出排除叶表反射后，第2层叶片真实激发的荧光比例，各激发光强下，各特征点F0、FI、FJ、FP平均值约为6.98%、11.26%、9.49%和7.78%。增加比例约为10%。

结论

综合以上实验结果，我们证明了：

叠加后增加的荧光产量一部分来自于第2层叶表对第1层叶片激发荧光的反射，还有一部分来自于第2层叶片自身的激发。

在200～3000umolm s激发光强下，随激发光强的增加，荧光产量增长幅度逐渐增大，增长率保持在20%。叶表面反射与第2层叶片的激发分别占荧光产量的10%左右。

台湾学者的叶片叠加实验存在一些问题，即没有考虑叶表面（蜡质）对荧光的反射。因此他得出的结果尚不够完善。

本次实验证明了叶片结构尤其是细胞层数、叶表蜡质对叶绿素荧光产量存在的影响。因此日后在运用叶绿素荧光的数学模拟方法分析不同种类叶片浅表的光能吸收、捕获和分配，以研究叶片的光合作用时，需得考虑叶片结构的不同点，如叶片厚度、细胞层数、叶表蜡质厚度等。

展望

本次实验分析探究了叶片叠加后荧光产量增加的原因，后续的实验可以继续研究叶面反射、下层叶片细胞乃至深层细胞激发占增加荧光产量的精确比例，也可以选择不同叶片厚度、不同叶表蜡质厚度的叶片进一步证明叶片结构对荧光产量的影响。

本次实验可以推动荧光理论的发展，应用到对荧光测定和分析技术的完善，以及对荧光仪的改进之中，为植物光合作用和抗逆研究提供重要实验支持。