NKT细胞激活剂α-Galcer对小鼠红白血病的抑制作用

孙贺军 王佳骥 王 姗 刘 遄 陈 光 左蓉洁 闫振宇 郑全辉

华北理工大学基础医学院,①附属医院血液病科 河北唐山 063000

NKT细胞激活剂α-Galcer对小鼠红白血病的抑制作用

孙贺军 王佳骥 王 姗 刘 遄 陈 光 左蓉洁 闫振宇①郑全辉

华北理工大学基础医学院,①附属医院血液病科 河北唐山 063000

①目的 采用尾静脉注射制备小鼠红白血病模型，探讨α-半乳糖苷神经酰胺(α- Galcer)对红白血病发生和发展的影响。②方法 体外培养小鼠红白血病细胞系FBL-3，经尾静脉注射接种C57BL/6小鼠。将FBL-3接种小鼠进一步分为α- Galcer处理组和溶剂对照处理组，于FBL-3接种当天分别注射α- Galcer和溶剂DMSO.观察不同处理组FBL-3细胞接种小鼠总体变化，并于FBL-3接种后第8周处死小鼠，观察外周血血象变化和肿瘤结节形成情况。③结果 与正常小鼠相比，FBL-3细胞接种小鼠实验期间皮肤感染增加。外周血有核红细胞增加，并且出现明显的实体器官肿瘤结节，而α- Galcer处理显著抑制实体器官肿瘤结节的形成。④结论 通过FBL-3细胞尾静脉注射初步建立红白血病肿瘤小鼠模型，α- Galcer处理对小鼠白血病的发展发挥抑制作用。

α-半乳糖苷神经酰胺 红白血病 肿瘤小鼠模型

自然杀伤性T细胞(NKT)是近年来新发现的一个具有调节功能的T细胞亚群，通过特异识别糖脂类抗原后活化并迅速产生大量不同类型细胞因子，在肿瘤、自身免疫病和炎症性疾病的发生和发展过程中发挥重要作用[1]。α-半乳糖苷神经酰胺(α- Galcer)是从海绵提取物中发现的一类NKT细胞激活剂，在肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤等实验研究中显示抗肿瘤活性[2～4]。在此研究中,笔者采用小鼠红白血病细胞系FBL-3制备白血病移植肿瘤模型，并观察了α-Galcer对红白血病发生和发展的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 FBL-3小鼠红白血病细胞购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.1.2 动物来源 C57BL/6小鼠由中国食品药品检定研究院提供[许可证号：SCXK(京)2009-0017],SPF级环境培养。

1.1.3 主要试剂 α-Galcer购于上海西宝生物科技有限公司，二甲基亚碸(DMSO)购于北京康辉试剂有限公司，DMEM高糖培养基，胎牛血清、青霉素/链霉素双抗购自北京经日金典科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 FBL-3细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖培养液中培养，条件是饱和湿度、37℃、5%CO2。当细胞培养液略微变黄(细胞密度达95%以上)，用移液管轻轻吹打瓶壁，直接将培养液吸入离心管离心(1000r/min)，进行1：2或1：3 传代培养扩增。

1.2.2 小鼠尾静脉注射接种 离心收集FBL-3细胞，无菌PBS洗涤2次后用台盼蓝染色检测细胞活性在95%以上并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×107/mL，对小鼠进行尾静脉注射接种。分组：取6～8周龄，雄性C57BL/6小鼠24只，随机分成α-Galcer处理组、溶剂对照组和正常对照组，每组8只。α-Galcer处理组和溶剂对照组进行FBL-3细胞尾静脉注射，剂量为1×106细胞/(100μL·只)。

1.2.3 α-Galcer 处理 α-Galcer用DMSO溶解，浓度为100μg/mL，-80℃保存。临用时用无菌PBS进一步稀释成备用浓度。α-Galcer处理组小鼠于FBL-3细胞接种当天腹腔注射α- Galcer1次,剂量为6μg/只，溶剂对照组注射等量DMSO/PBS溶液，正常对照组不做任何处理。FBL-3细胞接种后定时检测小鼠大体生长情况和体质量变化，8周后解剖小鼠观察血液及实体器官肿瘤形成。

1.2.4 小鼠血涂片检测 FBL-3细胞接种8周后，取小鼠尾静脉血制备血涂片，加瑞氏染液室温染1分钟，再滴加稍多PBS缓冲液稀释染液，静置染色5～10分钟，流水冲洗，镜下观察。

2 结果

2.1FBL-3红白血病细胞培养 常规培养FBL-3小鼠红白血病细胞，当其密度达到细胞瓶的95%时传代、扩增培养，直至细胞数量达到接种要求，见图1。

2.2FBL-3细胞注射小鼠总体变化 与正常对照组小鼠相比，FBL-3细胞注射组和FBL-3细胞+α-Galcer处理组小鼠实验期间体质量均有所降低，但各组间无明显差异，见图2。另外，实验期间各组小鼠均未见死亡，但FBL-3细胞注射组有7只小鼠4周后开始出现精神萎靡, 步态不稳，活动明显减少，并有4只小鼠局部皮肤出现感染现象；FBL-3细胞+α-Galcer处理组除4只小鼠局部皮肤出现感染现象外，其它未见明显变化。

图2FBL-3细胞注射组和FBL-3细胞+α-Galcer处理组小鼠体质量改变

2.3FBL-3细胞注射小鼠血象变化 与正常对照组小鼠相比，各有7只FBL-3细胞注射组和FBL-3细胞+α-Galcer处理组小鼠外周血有核红细胞增加，其中FBL-3细胞注射组增加最为显著，见图3。

2.4FBL-3细胞注射小鼠成瘤检测FBL-3细胞注射组小鼠在第8周时，部分小鼠体内可见明显的肿瘤结节，主要出现在肝脏，也可见其它部位，如颅腔，见图4；而FBL-3细胞+α-Galcer处理组小鼠体内未见明显肿瘤结节形成。

ab

注：a:各实验组小鼠外周血细胞涂片染色，箭头所指为有核红细胞。放大倍数：400×；b:各实验组小鼠外周血有核红细胞统计分析。

图3FBL-3注射小鼠外周血有核红细胞变化

a b

注：a:肝脏和颅内肿瘤结节；b:FBL-3细胞单独和FBL-3细胞+α-Galcer处理组小鼠体内肿瘤结节比较。

图4FBL-3注射小鼠体内肿瘤结节形成

3 讨论

FBL-3细胞为Friend病毒诱发的红白血病细胞系，能够在体外连续传代培养，可经皮下、腹腔、颅内和静脉注射在DBA2和C57BL/6小鼠体内诱发同种移植性白血病。在此研究中，据文献[5],笔者采用尾静脉注射1×106FBL-3细胞/只小鼠建立小鼠红白血病模型,并观察NKT细胞特异激活剂α-Galcer对肿瘤形成的抑制作用。与文献报道[6]不同，在FBL-3细胞接种小鼠8周后，笔者未观察到FBL-3细胞注射小鼠出现明显死亡现象，但表现出明显的外周血有核红细胞增加(87.5%)和局部皮肤感染症状(50%)。另外，FBL-3细胞注射小鼠可见肝脏和颅内肿瘤结节形成，符合白血病细胞容易浸润肝、肺、肾、脑等实体器官的特点。因此，本实验中所建立的红白血病小鼠模型是基本成功的，由于本实验中所使用的FBL-3细胞系已在不同单位和经不同条件下体内、外培养传代, 随着时间的推移, 细胞系的特性可能已发生变化, 而这些变化可能导致笔者的实验结果与文献报道有所差异。

虽然FBL-3细胞+α-Galcer处理组小鼠也出现外周血有核红细胞增加和易发感染等白血病相关症状，但与FBL-3细胞单独注射组相比，在实验期间未出现明显的体内肿瘤结节，表明α-Galcer对红白血病的发展具有一定抑制作用。笔者以前实验结果表明，α-Galcer处理导致NKT细胞显著增加[3]。活化NKT细胞能够通过释放穿孔素/颗粒酶或者表达FasL/Fas直接杀伤肿瘤细胞，也能通过分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子进一步活化NK和CD8+T细胞，间接发挥抗肿瘤作用[7]。另外，α-Galcer还具有显著抑制肿瘤细胞转移的作用[4]。综合以上机制，可能导致α-Galcer处理组小鼠未出现明显的体内肿瘤结节，但其确切机制尚需后续实验证实。

[1] 李 娟，郑全辉.NKT细胞研究进展[J].中国免疫学杂志,2015,31(5):700-703

[2]FaithC,Robertson,JayA,etal.NKTCellNetworksintheRegulationofTumorImmunity[J].FrontImmunol,2014,5:543

[3] 田 雨,王 娜,宋天姣,等.NKT细胞激活剂α-Galcer对小鼠肺肿瘤细胞生长的影响[J].华北理工大学学报(医学版),2016,4(18):323-325

[4] 郑全辉，张爱红，郑爱华，等.MiR-150缺失增强小鼠NKT细胞IFN-γ产生并抑制黑色素瘤细胞的肺转移[J].生物化学与生物物理进展,2013,40(5):454-460

[5] 庄万传，李秀梅，朱贵华，等.以髓外浸润为首发表现的急性髓系白血病15例[J].白血病．淋巴瘤,2014,5(2):117-119

[6]ZhouJ,LiYN,SongYP,etal.EstablishmentofanerythroleukemiamodelinCB6F1micebytransplantwithhaploidenticalmouseleukemiccelllineFBL-3[J].ZhongguoShiYanXueYeXueZaZhi，2010,18(5):1128-1131

[7]WeinkoveR,BrooksCR,CarterJM,etal.FunctionalinvariantnaturalkillerT-cellandCD1daxisinchroniclymphocyticleukemia:implicationsforimmunotherapy[J].Haematologica，2013,98(3):376-384

(2016-11-25 收稿)(王一伊 编辑)

Inhibitory effect of NKT cell stimulator α-Galcer on development of erythroleukemia

SUN Hejun,WANG Jiaji,WANG Shan,et al

(College of Elementary Medicine,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

Objective To prepare erythroleukemia mouse model through tail vein injection of FBL-3 cell and investigate the effect of α- Galcer on the occurrence and development of erythroleukemia.Methods FBL-3 erythroleukemia cells were cultured in vitro and C57BL/6 erythroleukemia mouse models were prepared by tail vein injection of FBL-3 cells. The FBL-3 injected mice were further divided into two groups by injecting α- Galcerand solvent DMSO respectively on the date of FBL-3 injection. The overall changes of FBL-3 injected mice in each group were observed during this experiment. 8 weeks after FBL-3 injection, the FBL-3 injected mice were killed and peripheral blood and tumor nodules formation were detected. Results Compared with normal C57BL/6 mice, the FBL-3 injected mice demonstrated obvious skin infection, increased nucleated red blood cells and apparent tumor nodules formation, whileα- Galcer treatment significantly inhibited the formation of tumor nodules on solid organs. Conclusion Erythroleukemia mouse models were prepared preliminarily by tail intravenous injection of FBL-3 cells, and α- Galcer treatment exhibited an inhibitory effect on the development of leukemia in mice.

α- Galcer.Erythroleukemia.Tumor mouse model

华北理工大学大学生创新创业训练计划项目(编号:X2016092)；国家自然科学基金项目(编号:81373111)

孙贺军(1994-)，男，本科生。研究方向：肿瘤免疫。

郑全辉。

Q 784

A

2095-2694(2017)03-169-04