海藻糖对乳酸杆菌耐热和室温贮存保护作用的研究

王 芳，康 超，林 静，杨 玲，倪学勤，曾 东

（1.贵州省生物研究所，贵州贵阳550009；2.四川农业大学动物医学院动物微生态工程研究中心，四川成都611130）

海藻糖对乳酸杆菌耐热和室温贮存保护作用的研究

王 芳1，康 超1，林 静1，杨 玲1，倪学勤2，曾 东2

（1.贵州省生物研究所，贵州贵阳550009；2.四川农业大学动物医学院动物微生态工程研究中心，四川成都611130）

乳酸杆菌不耐高温和室温贮存是其应用于饲料添加剂的一大限制因素，本试验旨在研究5%（W/V）的海藻糖对三株乳酸杆菌在高温处理和室温贮存条件下的保护作用。结果表明：海藻糖能显著提高乳酸杆菌耐热性和室温贮存的存活率，且不同菌株抗逆性能不同，其中F22菌株表现出较G31和H51两株菌更好的耐热性和耐贮性。添加海藻糖保护的F22菌株70℃处理5 min，活菌数为（6.0±0.1）×105cfu/mL，对照组为（1.2±0.1）×102cfu/mL；室温贮存15 d，添加海藻糖的试验组存活率为（127.94±0.23）%，对照组为（89.45±0.78）%。由此可见，海藻糖可作为微生态制剂高温加工和室温贮存的保护剂，提高乳酸杆菌的耐热性和延长保质期。

微生态制剂；乳酸杆菌；海藻糖；存活率

微生态制剂是含活菌同时也含死菌及其代谢产物的有益微生物制品。饲喂微生态制剂可以改善动物肠道微生物菌群，提高饲料转化率，增强动物机体免疫力，达到防病治病提高生产性能的目的。微生态制剂是抗生素的有效替代品，在饲料中添加微生态制剂是解决动物耐药性的有效途径之一。目前，国内外市场上的微生态制剂主要以乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌为主（张坤等，2014）。其中，乳酸菌属是动物肠道中的有益微生物，主要有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌等，该类制剂在生产、运输、贮存过程中极易受高温、高压、氧化、干燥等不良环境的影响，导致制剂中活菌数减少，影响货架期和功效稳定性（Liu等，2011）。因此，保持微生态制剂中益生菌活性至关重要。研究表明，在高温、冷冻、干燥等恶劣环境下，海藻糖能在细胞表面形成独特的保护膜，有效保护生物分子结构不被破坏，提高微生态制剂的活菌存活率，延长活菌制剂的贮存期（靳文斌等，2015；张云光等，2010；戴秀玉等，2001）。

本文研究了高温处理和室温贮存条件下，海藻糖对乳酸杆菌的保护作用，以期为微生态制剂的研究、生产提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 乳酸杆菌F22、G31、H51菌株，由四川农业大学动物微生态工程研究中心提供，其中F22和H51属发酵乳杆菌，G31属德氏乳杆菌德氏亚种（丁轲等，2004）。

1.1.2 药品 海藻糖（含量＞98%）购于日本林原生物有限公司。

1.1.3 培养基 LBS培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 mL、K2HPO42 g、醋酸钠5 g、枸橼酸钠2 g、MgSO4· 7H2O 200 mg、MnSO4·H2O 50 mg、琼脂25 g、蒸馏水1000 mL，pH 6.0～6.5，115℃灭菌20 min。

1.1.4 主要仪器及器材 超净工作台（苏州净化设备有限公司），二氧化碳培养箱311（Thermo），数显恒温水浴锅HH-6（金坛市富华仪器有限公司），高压蒸汽灭菌锅BXM-30R（上海博迅），移液器（Eppendorf），Tip头、玻璃试管、移液管等均为国产。

1.2 方法

1.2.1 乳酸杆菌的培养 将乳酸杆菌F22、G31、H51分别接种于LBS液体培养基中，置于37℃恒温箱中厌氧培养24 h。

1.2.2 海藻糖对乳酸杆菌耐热保护性的测定 将培养24 h的乳酸杆菌F22、G31、H51菌液，分别分装到不同试管中，每支试管10 mL。分别将装有F22、G31、H51菌液的试管分为两组，以加入5%的海藻糖为试验组，以不加海藻糖为对照组。将装有不同菌液的试管放入70℃的恒温水浴锅中分别处理3 min和5 min，测定乳酸杆菌初始活菌数（处理前活菌数）和高温处理不同时间后的活菌数，并计算其存活率。

样品稀释：利用10倍递增稀释法将对照组和试验组乳酸杆菌F22、G31、H51菌液分别稀释108倍，取对照组 106、107、108稀释度和试验组 103、104、105、106、107、108稀释度的菌液，用滴种计数法测定乳酸杆菌活菌数。

滴种计数法：将待测物稀释到适当的倍数，用移液器取20 μL滴加于LBS固体培养基上，每个稀释度做三个重复，37℃培养24 h计数。活菌数及存活率的计算公式为：

活菌数/（cfu/mL）=活菌数平均值×稀释倍数×50；

1.2.3 海藻糖对乳酸杆菌常温贮存保护性的测定将培养24 h的乳酸杆菌F22、G31、H51菌液，分别分装到不同试管中，每支试管10 mL。分别将装有F22、G31、H51菌液的试管分为两组，以加入5%的海藻糖为试验组，以不加海藻糖为对照组，在室温避光条件下分别贮存1、3、5、10、15 d，测定乳酸杆菌初始活菌数（处理前活菌数）和贮存不同时间后的活菌数，并计算其存活率，测定及计算方法同1.2.2。

1.3 数据处理 试验每个处理3个重复，结果用“平均值±标准差”表示。数据采用SPSS 19.0软件进行处理。

2 结果

2.1 海藻糖对乳酸杆菌耐热性的影响 海藻糖对乳酸杆菌耐热性的影响见表1，三株乳酸杆菌F22、G31、H51经70℃处理后活菌数降低103～108倍，处理3 min和5 min差异极显著，活菌存活率随高温处理时间延长显著下降。添加海藻糖的试验组活菌数与对照组差异极显著，其中F22菌株70℃处理3 min试验组活菌数是对照组的2.4倍，处理 5 min试验组活菌数是对照组的1000倍；G31和H51菌株70℃处理3 min后试验组活菌数比对照组分别提高105和104倍，处理5 min后仍有活菌，但对照组活菌数为0。表明添加海藻糖能够显著提高乳酸杆菌对高温的耐受性；三个试验菌株中F22活菌存活率最高，说明不同菌株对高温耐受能力不同。

表1 海藻糖对乳酸杆菌耐热性的影响

2.2 海藻糖对乳酸杆菌常温贮存的影响 海藻糖对乳酸杆菌常温贮存的影响如表2所示，F22菌株试验组于贮存第1、5、10、15天出现4次增长高峰，活菌数显著高于初始活菌数，而对照组活菌数仅于贮存第5天比初始活菌数高；试验组和对照组活菌数均于贮存第3天出现显著下降，但添加海藻糖的试验组活菌数较对照组高1倍；贮存15 d，试验组菌株存活率显著高于对照组，分别为（127.94±0.23）%和（89.45±0.78）%。H51菌株贮存1 d后，试验组活菌数比初始活菌数增加 3.0× 108cfu/mL，对照组活菌数下降2.0×108cfu/mL；贮存15 d，试验组和对照组活菌数均下降3个数量级。G31菌株活菌数随着贮存时间的延长逐渐下降，试验组活菌数与对照组活菌数的变化无显著差异；贮存15 d，试验组活菌存活率显著高于对照组，分别为（28.37±1.12）%和（9.01±0.35）%。经过15 d的贮存，三株乳酸杆菌活菌存活率从高到低顺序为：F22试验组＞F22对照组＞G31试验组＞G31对照组＞H51对照组≈H51试验组。乳酸杆菌室温贮存添加海藻糖可显著提高活菌存活率，不同菌株活菌存活率存在显著差异，与菌株生物特性有关。

表2 海藻糖对乳酸杆菌常温贮存的影响

3 讨论

3.1 海藻糖对乳酸杆菌耐热保护作用 本试验结果表明，添加5%的海藻糖对乳酸杆菌有一定的耐热保护作用，但对不同菌株的影响差异显著，对F22菌株的耐热保护性优于G31和H51，添加海藻糖保护的F22菌株70℃处理5 min活菌数比G31和H51高5个数量级；对照组比其余两组高2个数量级，说明不同菌株耐热性不同。李梦菲（2015）研究表明，高产β-半乳糖苷酶的耐热乳酸菌其耐热性与蛋白质一级和二级结构的改变有关。黄沧海（2004）报道，乳酸菌不耐热，75℃处理15 min存活率为45.1%，70℃处理10 min之后基本没有活菌。冯镇（2008）报道，乳酸菌在高温条件下，产生自溶，由于自溶酶在温度较高时活性较强，加快了对乳酸菌细胞壁的水解，导致菌体细胞裂解；加之菌体蛋白在高温时变性，从而导致活菌数下降。本试验中添加5%海藻糖的F22菌株经过70℃处理5 min活菌数比对照组高3个数量级，说明添加海藻糖能提高乳酸杆菌的耐热保护性。海藻糖具有降低膜相变温度的作用，能够保护干燥细胞的蛋白质结构，在高温干燥过程中提高细胞存活率 （李滢冰等，2000）。戴秀玉（2001）研究发现，海藻糖对干燥状态下细胞的耐高温保护效果更好，细胞存活率比溶液状态高3～4个数量级。乳酸杆菌不耐高温是其应用于饲料添加剂的一大限制因素，开展耐热乳酸杆菌和保护剂的筛选尤为重要。

3.2 海藻糖对乳酸杆菌常温贮存的影响 本试验添加5%的海藻糖对不同乳酸杆菌菌株的保护性差异显著，三株乳酸杆菌贮存15 d活菌存活率分别为：F22试验组和对照组分别为 （127.94± 0.23）%和（89.45±0.78）%，G31试验组和对照组分别为（28.37±1.12）%和（9.01±0.35）%，H51试验组和对照组分别为 （0.0005±0.0001）%和 （0.0006± 0.0001）%。三株乳酸杆菌中添加海藻糖保护的F22菌株不但活菌数没有下降，反而比初始活菌数提高27.94%，G31菌株活菌数显著下降，但添加海藻糖的试验组活菌数存活率比对照高约20%，H51菌株试验组与对照组无显著差异。海藻糖通过在菌体外部形成保护膜，保护生物膜和蛋白质等在不良环境中免受伤害，并且使菌体不受自身代谢产物的影响，从而提高乳酸杆菌室温贮存的活菌数， 延长保质期 （Colaco等，1995；Wiemken等，1990）；不同乳酸杆菌菌株在室温贮存过程中活力不同，与其生物特性有关。

4 结论

添加5%的海藻糖能够显著提高乳酸杆菌在高温处理和室温贮存条件下的存活率，其中F22菌株耐热性和室温贮存的存活率比G31和H51菌株更好。海藻糖可作为微生态制剂高温加工和室温贮存的保护剂，但要提高乳酸杆菌的耐热性和延长其保质期，还应从选育抗逆性好的菌种着手。

[1]戴秀玉，沈义国，周坚.海藻糖对乳酸菌的抗逆保护研究[J].微生物学通报，2001，28（2）：46～50.

[2]丁轲，倪学勤，潘康成，等.鸡源乳酸杆菌优良菌株的筛选[J].饲料工业，2004，25（3）：20～22.

[3]冯镇，张兰威.乳酸杆菌LB-3自溶酶特性研究 [J].中国乳品工业，2008，9：18～21.

[4]黄沧海，谯仕彦，李德发.饲用发酵乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum）生物学特性的研究[J].江西农业大学学报，2004，4：596～600.

[5]靳文斌，李克文，胥九兵，等.海藻糖的特性、功能及应用[J].精细与专用化学品，2015，23（1）：30～33.

[6]李梦菲，孙庆惠，张彦，等.耐热乳酸菌的筛选及其-半乳糖苷酶性质分析[J].食品工业科技，2015，36（18）：209～218.

[7]李滢冰，池振明.酵母中海藻糖与抗逆境的关系[J].食品研究与开发，2000，21（4）：6～8.

[8]张坤，周全州，王宏伟.动物微生态制剂的研究进展[J].中国饲料添加剂，2014，143：4～7.

[9]张日俊.动物微生态制剂（益生菌）的标准、评价规程、功能和发展趋势[J].饲料工业，2015，36（4）：1～7.

[10]张云光，岳田芳，梁莲华，等.海藻糖在微生态制剂中的应用[J].广西轻工业，2010，8：4～6.

[11]Cclaco C，Kampinga J，Roser B.Amorphous stability and trehalose[J]. Science，1995，268（5212）：788～788.

[12]Liu S，Han Y，Zhou.Lactic acid bacteria in traditional fermented Chinese foods[J].Food Research International，2011，44（3）：643～651.

[13]Wiemken A.Trehalose in yeast stress protectant rather than reserve carbohydrate[J].Antonie Van Leeuwenhoek，1990，59（3）：209～217.

Lactobacillus is not resistant to high temperature and room temperature storage，which is one of the main limit factor to its application in feed additives.This study aimed to investigate the 5%（m/V）of trehalose on three Lactobacillus under the condition of high temperature and room temperature storage.The results showed that trehalose can significantly increase survival rates of Lactobacillus thermal stability and room temperature storage，and different strain resistance was different.F22 showed better heat resistance and storability than G31 and H51.F22 in the added trehalose group was put in the condition of 70℃deal with 5 min，the number of living bacterium was（6.0±0.1）×105cfu/mL，the control group was（1.2± 0.1）×102cfu/mL；Stored at room temperature for 15 days，survival rate of treatment group was （127.94±0.23）%，the control group was（89.45±0.78）%.It was concluded that the trehalose can be used as protectant in high-temperature processing and room temperature storage，which can improve the heat resistance of Lactobacillus and extend the shelf life.

microbial ecological agents；Lactobacillus；trehalose；survival rate

S816.79

A

1004-3314（2017）10-0017-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171004

贵州科学院2013年基金项目；贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY[2015]3017-2号）；贵州省科学技术基金计划项目（黔科合J字[2014]2115号）；贵州省科技厅重大专项（黔科合重大专项字[2013]6014）；贵州省科技支撑项目（黔科合支撑[2016]2600号）