气相色谱-质谱法分析冷鲜滩羊肉微生物差异代谢物

张同刚，苏春霞，李俊丽，张丽文，罗瑞明

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

气相色谱-质谱法分析冷鲜滩羊肉微生物差异代谢物

张同刚，苏春霞，李俊丽，张丽文，罗瑞明*

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

以托盘密封包装的冷鲜滩羊肉为研究对象，基于气相色谱-质谱平台对其中微生物的代谢物组进行检测，区分不同贮藏时间生物样本之间的差异，寻找出造成上述差异的变量或分子，并将该差异物映射到滩羊肉主要腐败菌假单胞菌属（Pseudomonas）相应的代谢途径中，分析其代谢的相对强度。采用模式识别方式正交偏最小二乘法判别分析将不同贮藏时间组完全区分。结果表明：该差异代谢物所映射的代谢途径中三羧酸循环、精氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代谢及磷酸戊糖途径的代谢强度相对较高。说明基于气相色谱-质谱技术对微生物的代谢物组进行检测，寻找并鉴定差异代谢物是可行的。

滩羊；微生物；差异代谢物；气相色谱-质谱

宁夏盐池滩羊是经长期自然选择和人工选育而成的裘肉兼用型品种，被农业部列为国家二级保护品种。其肉脂肪分布均匀，膻味较轻，肉质细嫩鲜美，营养丰富，风味独特，深受广大消费者的喜爱[1-3]。冷鲜滩羊肉是指对严格执行检疫制度屠宰后的胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度（以后腿为测量点）在24 h内降为0～4 ℃，并在后续的流通过程中始终保持在0～4 ℃范围内的鲜羊肉[4-8]。

随着我国人民生活水平的提高，冷鲜肉正逐渐成为我国肉类消费的主流，在冷鲜肉推广的过程中微生物对于货架期的影响是面临的最大问题之一，只有保证食品质量安全，冷鲜肉才能快速稳定的进一步发展[9-12]。而微生物代谢物作为生物信息传递的终端层次，在基因功能诠释和代谢状态分析等方面显现出了很大的潜力。代谢组学技术能对代谢物的集合进行分析，使代谢物变化规律的研究系统化[12-16]。现有的主要检测手段包括：核磁共振技术、液相色谱-质谱联用技术、毛细管电泳-质谱联用技术以及气相色谱-质谱联用技术[16-24]。Cevallos-cevallos等[25]利用毛细管电泳二极管阵列、液相色谱-质谱和气相色谱-质谱3种检测方法，结合主成分分析和偏最小二乘法，对鸡肉和牛肉中的大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌进行了检测。目前，对于滩羊肉微生物的研究大多为抑菌，而对于其微生物代谢行为及代谢过程的报道较少。

本研究以托盘密封包装的冷鲜滩羊肉为研究对象，基于气相色谱-质谱平台对其中优势微生物的代谢物组进行系统性检测，而后采用模式识别方式，区分冷鲜滩羊肉不同贮藏时间生物样本之间的差异，既而找寻出造成上述异同的变量或分子，即差异代谢物。差异代谢物的寻找有助于深入探究微生物代谢行为及代谢过程，为进一步揭示微生物代谢途径的相对强度、延长冷鲜滩羊肉货架期及开发保鲜新技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滩羊后腿肉，采自宁夏吴忠市涝河桥牛羊肉产业有限公司；滩羊饲养期间不做任何生物性防疫工作，且定期进行清粪、消毒处理，密封托盘包装。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪 美国Agilent公司；LECOChroma TOF PEGASUS HT质谱仪 美国LECO公司；JXFST PRP-24研磨仪 上海净信科技有限公司；TGL-16M型高速冷冻台式离心机 湘仪离心机仪器有限公司；240分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

采集贮藏温度为0 ℃，相对湿度为85%的滩羊肉表面刮擦物100 mg（含微生物、血液、肉汁液等），封装于灭菌冷冻管中待用。采样周期为4 d，即采样时间点为0、4、8、12 d，每组样本做5 个平行。

1.3.2 样品预处理

将冷鲜贮藏的滩羊后腿肉表面刮擦物100 mg（含菌落、血液、肉汁液等），快速投入液氮中进行1 min淬灭，解冻后在－9 ℃，12 000×g离心3 min，去除上清液得到菌体。收集50 mg菌体于2 mL EP管中，加入液氮、0.4 mL甲醇-氯仿（3∶1，V/V）溶液，提取胞内代谢物，后加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸作为内标，加入钢珠，用研磨仪（65 Hz）匀浆研磨处理3 min，匀浆后在4 ℃，12 000×g离心15 min，小心取出350 μL上清液于2 mL样品瓶中。将提取的代谢物置于37 ℃真空浓缩器中干燥约3.5 h后，加入80 μL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐溶于吡啶20 mg/mL），轻轻混匀后，放入80 ℃烘箱中孵育20 min，之后向每个样品中迅速加入100 μL衍生化试剂双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷，V/V），将混样在70 ℃烘箱中孵育1 h，待混样冷却至室温，加入5 μL脂肪酸甲酯（饱和脂肪酸甲酯标准混合液，溶于氯仿，C8～C16：1 mg/mL；C18～C24：0.5 mg/mL）混匀，得到分析样品，待上机检测。

1.3.3 气相色谱-质谱联用仪条件

Restek Rxi-5Sil MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序：前进样口吹扫流速3 mL/min，起始柱温60 ℃，保持1 min后，以10 ℃/min速率升至330 ℃，保持10 min；进样口温度280 ℃；载气为高纯度He，流速1 mL/min；进样量1.0 μL，不分流。接口温度280 ℃，传输线温度280 ℃；离子源温度220 ℃；质量扫描范围m/z 85～600；扫描速率20 spectra/s；溶剂延迟时间6 min；电子电压70 eV。

1.4 数据处理

使用SIMCA软件（V14, Umetrics AB，Umea，Sweden）对归一化后的数据进行多元变量模式识别分析。采用监督模式识别方法正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），以便将不同生物样本之间的差异归类区分。模型的质量用7折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到的R2Y（代表Y变量的可解释性）和Q2（代表模型的可预测性）对模型有效性进行评判[26-30]。进一步结合差异代谢物引起两组之间差异所占的权重识别差异化合物及KEGG数据库划分代谢物所属途径并分析其代谢强度。

2 结果与分析

2.1 数据预处理

为了去除噪音数据，采用四分位数极差或四分位间距法对数据进行过滤，以便更好对下游数据进行分析；而后采用最小值二分之一法对原始数据中缺失值进行模拟、填补；最后对填补完以后的数据进行标准化处理，方法是内标归一法，过滤后，还有325 个有效峰，如图1所示。

图 1 20 例滩羊后腿肉表面刮擦物的总离子流图Fig. 1 GC-MS total ion current chromatogram for intracellular metabolites from bacterial cells scrapped from the surface of 20 samples of Tan sheep hind leg muscle

2.2 多元变量分析

应用主成分分析对冷鲜滩羊后腿肉贮藏0 d组与4 d组，4 d组与8 d组和8 d组与12 d组表面刮擦物气相色谱-质谱进行数据分析。

图 2 冷鲜滩羊肉贮藏4 d组和0 d组（A）、8 d组和4 d组（B）、12 d组和8 d组（C）的OPLS-DA得分图Fig. 2 Score plots of OPLS-DA model obtained for Tan sheep meat stored for 4 days versus 0 days, for 8 days versus 4 days, for 12 days versus 8 days

为将各个滩羊肉冷鲜贮藏组区分开来，找到潜在的差异化合物，本实验采用OPLS-DA法对样本进行分析。由图2可知，滩羊肉冷鲜贮藏0 d组与4 d组，4 d组与8 d组和8 d组与12 d组能够完全区分，但冷鲜滩羊肉贮藏4 d组、8 d组与12 d组内呈一定的散发分布，这反映了滩羊肉冷鲜贮藏4 d组、8 d组与12 d组组内存在明显差异。

表 1 多元变量分析Table 1 Multivariate analysis

由表1可知，该模型的可解释变量（R2X）分别为0.393、0.350与0.406；监督模型的解释率（R2Y）分别为0.992、0.989与0.987；模型的可预测度（Q2）分别为0.759、0.660与0.804，说明该模型有很好的预测性。为了对模型的有效性做进一步检验，通过排列实验随机多次（n=200）改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值，进而验证模型的稳健性，见图3。置换检验截距分别为R2为0.966、0.964和0.959，Q2为－0.100、0.010和－0.111，很好地体现了模型的稳健性。表明基于气相色谱-质谱法建立的OPLS-DA模型能很好地解释冷鲜贮藏0 d组与4 d组、4 d组与8 d组和8 d组与12 d组，两两样本之间的差异。如图4所示，通过载荷图可获得一些潜在的差异化合物，即生物标记物，图中左右两端物质为潜在的差异化合物。选择OPLS-DA法处理数据，进行后续的差异代谢物的筛选与鉴定可以获得较好的效果。

图 3 冷鲜滩羊肉贮藏4 d组和0 d组（A）、8 d组和4 d组（B）、12 d组和8 d组（C）的置换检验Fig. 3 Permutation test of Tan sheep meat stored for 4 days versus 0 days, for 8 days versus 4 days, and for 8 days versus 12 days

2.3 差异化合物筛选与鉴定

表 2 滩羊肉冷鲜贮藏4 d组和0 d组的差异代谢物Table 2 Differences in metabolites from microorganisms in Tan sheep meat stored for 4 days versus 8 days

表 3 滩羊肉冷鲜贮藏8 d组和4 d组的差异代谢物Table 3 Differences in metabolites from microorganisms in Tan sheep meat stored for 8 days versus 4 days

表 4 滩羊肉冷鲜贮藏12 d组和8 d组的差异代谢物Table 4 Differences in metabolites from microorganisms in Tan sheep meat stored for 12 days versus 8 days

OPLS-DA既能过滤掉数据集中不相关的干扰信号，又能将样品分类属性识别作用发挥到极致，因而通过OPLS-DA获得的差异性代谢物更加可靠。当相似值介于200和700之间时，鉴定得到的代谢物是推断而来的；当相似值大于700，说明所得物质匹配度高，准确可信。

从表2～4可得，4 组冷鲜滩羊肉微生物代谢物的样本中鉴定出的30 种差异代谢物主要集中在糖类、糖醇和氨基酸及其衍生物等物质上。其中D-甘油酸、天冬酰胺在贮藏4 d时上调，而在8 d时下调；而1-磷酸葡萄糖、磷酸-5'-肌苷酸相对含量在4 d和8 d两个贮藏阶段内始终呈现递减趋势。在8 d和12 d两个贮藏时间段内，核糖峰面积平均值逐渐降低；1,5-脱水葡萄糖醇的相对含量随着贮藏时间的延长呈现出先增高后降低的趋势。对于乙酰苯胺而言，与0 d相比，在4 d时相对含量降低，而随着贮藏时间延长到12 d时其相对含量有所增长。其余差异化合物为各组内独有，其相对含量也呈现出升高或降低现象。

2.4 差异化合物代谢路径的分析

将上述所得差异化合物映射到KEGG数据库中，获得各差异化合物相应的代谢路径，并分析假单胞菌的代谢强度，见表5。

表 5 差异化合物代谢路径分析Table 5 Analysis of metabolic pathways for variable metabolites

30 种差异代谢物中，能与代谢途径精确匹配的代谢物有22 种。其余8 种差异物中，磷酸-5’-肌苷酸、异麦芽糖及羟脯氨酸3 种化合物的代谢途径是参考相关文献得出的；而乙酰苯胺、2-羟基戊酸、反-4-羟基-L-脯氨酸、牛磺酸及1,5-脱水葡萄糖醇5 种化合物未能将其映射到KEGG数据库相关的代谢通路中，可能是由于这几种化合物的信息未被收录到细菌代谢途径数据库中造成的。假单胞菌在所匹配的代谢路径中三羧酸循环、精氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代谢及磷酸戊糖途径的代谢强度相对较高。

3 结 论

本实验对滩羊肉冷鲜贮藏过程中微生物代谢物组进行整体性检测，OPLS-DA法能将冷鲜滩羊肉4 个贮藏时间组完全区分，但冷鲜滩羊肉贮藏4 d组和8 d组组内呈一定的散发分布，表明滩羊肉冷鲜贮藏4 d组及8 d组组内存在明显差异，可能是由于2 个组内5 个平行样本其微生物生长繁殖的速度及生长阶段不处于同一个水平。说明选择OPLS-DA法处理数据进行后续的差异代谢物的筛选与鉴定可以获得较好的效果。

本实验共鉴定出30 种能够精确匹配的差异代谢物。其所映射的代谢途径中三羧酸循环、精氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢及磷酸戊糖途径的代谢强度相对较高。在不同贮藏时间段，由于优势微生物群落的演替变化，其产生的差异代谢物相对含量呈现出不同变化趋势。说明基于气相色谱-质谱平台对微生物的代谢物组进行检测，寻找并鉴定差异代谢物是可行的。下一步实验将要结合差异代谢物分析主要腐败菌的代谢强度，探究微生物营养代谢组分变化与群落演替关联性。为深入探究微生物代谢行为及代谢过程、延长冷鲜滩羊肉货架期及开发保鲜新技术提供理论参考。

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GC-MS Analysis of Variation of Microbial Metabolites in Fresh Tan Sheep Meat during Chilled Storage

ZHANG Tonggang, SU Chunxia, LI Junli, ZHANG Liwen, LUO Ruiming*
(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

The quality of fresh Tan sheep meat is closely related to the metabolites produced by microbes during chilled storage. Metabolomics can systematically determine the pro les of intracellular and extracellular metabolites systematically and therefore contribute to qualitative and quantitative analysis. This study focused on the metabolomic analysis of microorganisms in tray-packaged Tan sheep meat during chilled storage by gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) and on the discrimination of the differences among biological samples with different storage times in order tond out the variables or molecules contributing to these differences. The variable metabolites were mapped to the corresponding metabolic pathways in the major spoilage bacteria Pseudomonas for analyzing the relative intensity of metabolism. The use of pattern recognition mode of orthogonal partial least squares analysis could complete distinguish different storage time groups. The results showed that the metabolism intensity of citric acid cycle, arginine metabolism, alanine, aspartic acid and glutamic acid metabolism and pentose phosphate pathway were relatively high. It is feasible tond out and determine the variable metabolites of microorganisms using GC-MS.

Tan sheep; microorganism; variable metabolites; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

10.7506/spkx1002-6630-201710047

TS251

A

1002-6630（2017）10-0291-06

张同刚, 苏春霞, 李俊丽, 等. 气相色谱-质谱法分析冷鲜滩羊肉微生物差异代谢物[J]. 食品科学, 2017, 38(10): 291-296.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710047. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Tonggang, SU Chunxia, LI Junli, et al. GC-MS analysis of variation of microbial metabolites in fresh Tan sheep meat during chilled storage[J]. Food Science, 2017, 38(10): 291-296. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710047.http://www.spkx.net.cn

2016-08-02

国家自然科学基金地区科学基金项目（31460431）

张同刚（1987—），男，博士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mail：372998013@qq.com

*通信作者：罗瑞明（1964—），男，教授，博士，研究方向为畜产品贮藏与加工。E-mail：ruimingluo.nx@163.com