富马酸二甲酯合成工艺中基因毒性杂质的质量控制研究

王珊珊，李 磊，王晓利，林云良，陈相峰＊

富马酸二甲酯合成工艺中基因毒性杂质的质量控制研究

王珊珊，李 磊，王晓利，林云良，陈相峰＊

（山东省分析测试中心,山东 济南 250014）

文章建立了气相色谱-质谱联用法测定富马酸二甲酯中硫酸二甲酯的方法，采用选择离子模式（SIM），内标法定量，方法检出限为10 ng/mL，在20～150ng/mL的线性范围内，线性相关系数达到0.996；方法精密度在1.5%～3.0%之间，精密度良好；8个小时内溶液响应的相对标准偏差仅4.22%，无明显变化，稳定性良好，该方法稳定性及精密度能完全满足富马酸二甲酯中硫酸二甲酯的分析研究。

气相色谱-质谱联用；选择离子模式；内标法定量；精密度

富马酸二甲酯是一种用途广泛且对微生物具有广谱﹑高效抑菌和杀菌作用的化合物[1]；富马酸二甲酯常用作食品防霉剂可以防止食品因霉菌微生物等引起的腐败变质，在延长食品的保鲜期限﹑减少运输和贮存过程所造成损失的方面起着越来越重要的作用。富马酸二甲酯具有低毒性，根据临床试验，由于对人体有腐蚀性和致过敏性，可经食道吸入对人体肠道﹑内脏产生腐蚀性损害和引起过敏[2-4]；硫酸二甲酯是一种高毒性化学品，世界卫生组织（WHO）曾经报道硫酸二甲酯是一种致癌致畸危险品，它可对核酸盐甲基化，被认为是强致癌剧毒物质[5]。硫酸二甲酯中毒特征主要是对眼﹑上呼吸道有强烈刺激作用，对皮肤有强腐蚀作用[6-7]。目前硫酸二甲酯的检测主要有气相色谱法[8-12]和液相色谱-质谱联用法[13-14]等。本文建立了富马酸二甲酯中硫酸二甲酯杂志的分析方法，利用气相色谱法-质谱联用法，选择离子模式进行测定，内标法定量分析，与外标法相比，内标定量法可以减小样品前处理及仪器不稳定造成的误差。

1 实验部分

1.1 检测条件及样品处理

仪器﹑色谱条件：气相色谱-质谱联用仪采用Agilent 7890A-5973N (GC-MS)；色谱柱采用AgilentHP-5（30m×0.25mm×0.25μm）；柱温箱升温程序：50℃保持3min以10℃/min升至130℃保持以30℃/min升至200℃保持3min以30℃/min升至280℃保持10min。进样口温度为200℃，采用脉冲不分流模式；载气使用高纯氦气；流速为1.0 mL/min；进样体积：1.0μL。

质谱条件：采集模式为选择离子模式（SIM）；离子源温度为230℃；四极杆温度：150℃；硫酸二丁酯（内标）﹑硫酸二甲酯质谱定量/定性离子见表1。

表1 硫酸二甲酯及硫酸二丁酯（内标）的质谱参数Table1 Mass parameters of dimethyl sulfate and butyl sulfate (internal standard)

储备溶液的配制：稀释溶剂用丙酮（色谱级）；对照品溶液：精密称定硫酸二甲酯标样（瑞阳制药有限公司提供）100.1mg，置于100mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得1.001mg/ mL标准溶液。精密量取上述储备标准溶液0.1mL置于100mL棕色容量瓶中，丙酮稀释至刻度，摇匀后得1.0g/mL标准储备溶液A。

内标：精密称定硫酸二丁酯（东京化成工业株式会社）100.2mg，于100mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得1.002mg/mL内标储备溶液。精密量取上述储备溶液1.0mL置于100mL棕色容量瓶中，丙酮稀释至刻度，摇匀后得10.0μg/mL内标储备溶液B。

供试品溶液：取富马酸二甲酯试样约400mg，精密称量，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮稀释定容，摇匀后超声5分钟，作为供试品溶液待测。

表3 线性范围、回归方程、检出限及定量限Table3 Linear range, regression equation, limit of detection and limit of quantitation

2 结果与讨论

2.1 专属性实验

空白溶剂：丙酮，待测。

空白样品溶液：精密称定空白样品400.1 mg，置10mL量瓶中，稀释定容，作为空白样品溶液，精密量取1.0mL上述溶液置于1.5mL进样瓶中，精密加入10μL内标储备液B，混匀，待测。

量取1.0mg/mL标准储备溶液﹑1.0mg/mL内标储备液各0.5mL，置于1.5mL进样瓶中，混匀，质谱全扫描模式上机检测，扫描范围29～300amu。采用NIST11谱库检索定性分析。

量取上述混合溶液0.1mL置于100mL棕色容量瓶中，丙酮稀释定容，混匀，取1.0mL于进样瓶中，气相色谱质谱联用仪（质谱选择离子模式）上机检测。分别精密量取上述溶液各1.0μL注入气相色谱质谱联用仪，记录总离子流图，结果见表2。从表2可见空白溶剂﹑空白样品对杂质测定均无任何干扰，待测组分及内标分离度良好。

表2 专属性试验结果Table2 Result of specific test

2.2 线性范围、定量限及检出限

精密量取硫酸二甲酯对照品储备溶液A1.5mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得150ng/mL标液；密量取硫酸二甲酯对照品储备溶液A 1.2mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得120ng/mL标液；密量取硫酸二甲酯对照品储备溶液A 0.9mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得90ng/ mL标液；密量取硫酸二甲酯对照品储备溶液A 0.5mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得50ng/mL标液；密量取硫酸二甲酯对照品储备溶液A 0.2mL，置于10mL棕色容量瓶中，丙酮定容，得20ng/mL标液；

分别精密量取上述标液各1.0mL置于1.5mL进样瓶中，分别准确加入10μL内标储备液B，混匀，待测。精密量取上述标准溶液各1.0μL，准确注入气相色谱-质谱联用仪，记录峰面积。以硫酸二甲酯浓度为横坐标，以硫酸二甲酯峰面积与内标峰面积比值为纵坐标做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。称取0.4g样品置于10mL棕色容量瓶中，精密加入对照品储备液（A）1.0mL，丙酮稀释定容，得100ng/ mL储备标液，逐级稀释对照品储备液，逐级精密量取稀释后溶液1.0μL，上机分析，当对照品浓度稀释至其信噪比（S/ N）约在10～15左右时即为仪器定量限，其信噪比(S/N)约在3～5时左右即为仪器检出限。以称取0.4g样品，丙酮溶解定容至10mL计本方法检出限，定量限。结果见表3。

2.3 方法精密度及溶液稳定性试验

称取富马酸二甲酯样品400mg，置于10mL量瓶中，精确加入对照品溶液（A）1.1mL，丙酮稀释配制浓度为110ng/ mL供试品溶液，精密量取上述溶液1.0mL置于1.5mL进样瓶中，准确加入10μL内标储备液B,混匀，待测。平行测定5次，计算RSD%，结果见表4。通过计算可知方法精密度在1.5%～3.0%之间，精密度良好。称取富马酸二甲酯样品400mg，置于10mL量瓶中，精确加入对照品溶液（A）1.1mL，丙酮稀释配制浓度为110ng/mL供试品溶液，精密量取上述溶液1.0mL置于1.5mL进样瓶中，置于室温放置0小时﹑2小时﹑4小时﹑6小时和7小时﹑8小时，精密量取1.0μL注入气相色谱-质谱联用仪，记录峰面积。结果见表5。对照品溶液在室温放置下硫酸二甲酯6个小时内衰减不明显，8小时后衰减9.5%。存在不稳定性，但8个小时内相对标准偏差仅4.22%，无明显变化，完全可满足供试品的测试需求，建议在实验室环境干燥的情况下进行试验，标样尽量现用现配。

表4 方法精密度试验Table4 Precision of the method

表5 溶液稳定性试验Table5 Stability of the solution

2.4 实际样品测定

取待测富马酸二甲酯试样8个批次，按上述方法检测，测定结果见表5。样品中硫酸二甲酯的含量均小于0.25ppm。样品加标色谱图见图1。

表6 实际样品检测Table6 Detection of real samples

图1 硫酸二甲酯及内标的色谱图Fig.1.Chromatogram of dimethyl sulfate and butyl sulfate (internal standard)

3 结论

采用气相色谱-串联质谱法选择离子模式测定富马酸甲酯中的硫酸二甲酯，检出限为10ng/mL，在20-150ng/mL的线性范围内，线性关系良好，该方法精密度在1.5%～3.0%之间，溶液在8个小时内稳定性良好，完全满足富马酸甲酯中硫酸二甲酯的测定。

[1] Liu Xiaogeng(刘晓庚).Theresearch progress of the dimethyl fumarate[J]. J.Chin.Cereal Oil Ass.（中国粮油学报），2010，25(4):116-120.

[2] Xu Lihong(徐丽红)，Wang Jianqing(王建清)，Ding Beijie(丁蓓茹)，等.Determination of dimethyl fumarate in three types of food by gas chromatography [J].Acta Agric.Zhejiangensis（浙江农业学报），2011，23(4):807-811.

[3] Wu Hui(吴晖)，Liu Lei(刘磊)，Li Xiaofeng(李晓凤)，等.The research status and application of dimethyl fumarate[J].J.Chin.Cereal Oil Ass.（中国粮油学报），2007，22(6):160-163.

[4] Han Zhoumi(阚周密)，Lin Jianyang(林建阳)，Wang Xidan(王戏丹).Rapid Determination of Dimethyl Fumarate in Food Poisoning by Gas Chromatographic-MassSpectrometric Method[J].Food Sci.（食品科学），2007，28(1):247-249.

[5] Wu Jie(吴杰)，Yao Chenzhi(姚晨之).Determinationofdimethyl sulfateinquaternaryammonium saltsurfactantbyheadspacegaschroma tography[J].China Surfactant Deterg.Cosmet.（日用化学工业），2009，39(5):354-357.

[6] Deng Guifeng(邓桂凤)，Yao Tongwei(姚彤炜).Determination of dimethyl sulphate residual in granisetronhydrochloride by headspace gas chromatography[J].J.ZheJiang Univ.（浙江大学学报），2008，37(2):156-158.

[7] Qin Xuanfu(覃宣富)，Zou Xiaoli(邹晓莉)，Li Yuanqian(黎源倩)，等.Determination of Ddimethyl Sulphate in Environmental Samples with GC-ECD[J].J.Sichuan Univ.（四川大学学报），2010，41(5):877-880.

[8] Li Xiaojuan(李小娟)，Ma Yongjian(马永建).Rapiddetermin ationofdimethylsulfateinairofworkplacewithgaschromatography[J].J.Chin.Ind.Med.（中国工业医学杂志），2010，23(4):301-302.[9] Fang Jinhong(方金红).Determination of dimethyl sulphate in synthetic paeonol samples by highperformance liquid chromatography coupled with pre-column derivatization[J].Anhui Med.Pharm.J.（安徽医药），2014，18(9):1646-1649.

[10] C.Schafer, P.Zollner.Determination of trace levels of dimethyl sulfate in the presence ofmonomethyl sulfate by gas chromatography-mass spectrometry[J].J.Chrom.A， 2013，1289(10):139-144.

[11] Yuan Jiawei(阮佳威)，Yao Hongyan(姚洪燕)，WangWeiwei(王薇薇)，等.Determination of two methyl sulfate residues in medicine by GC-MS[J].J.ZheJiang Shuren Univ.（浙江树人大学学报），2014，14(4):31-34.

[12] Pei Dejun(裴德君).Determination of two methyl sulfate and ethyl sulfate in textiles by gas chromatography mass spectrometry [J].J.Chin.Anal.Lab.（分析试验室），2015，34(1):31-34.

[13] Shi Yan(施燕)，He Zhigao(何志高).Determination of residue of dimethyl sulfate in drug by LC-MS /MS[J].J.Chin.Clin.Phar.（中国临床药学杂志），2016，25(3):164-167.

[14] N.Grinberg,F.Alb, K.Fandrick, etc.Assay at low ppm level of dimethyl sulfatein starting materials for API synthesis using derivatization in ionic liquid media and LC-MS[J].J.Pharmaceut.Biomed.，2013，75(5):1-6.

Validationof GC-MS Method for Dimethyl Sulfate in Dimethyl Fumarate

Wang Shanshan, Li Lei, Wang Xiaoli, Lin Yunliang, Chen Xiangfeng*
(Shandong Analysis and Test Centre, Jinan Shandong China 250014 )

Objective In this paper, a gas chromatography-mass spectrometrymethod was developed to determine dimethyl sulfate in dimethyl fumarate.Selective ion mode (SIM) mode and internal standard method was used in the method.The limit of detection of dimethyl sulfate was 10 ng/mL.The linear correlation coefficient was 0.996 in concentration from 20 ng/mL to 150 ng/mL.The precision of the method (RSD%, n=6) ranged from 1.5% to 3.0%.The RSD% of response for sample solution was 4.22% in 8 hours which indicated the stability of the method was acceptable.This method can be used for dimethyl sulfateanalysis in dimethyl fumarate.

Gas chromatography-mass spectrography; Selected Ion Mode; Internal standard Method; Precision

Q81 [Document Code] A

10.11967/ 2017150209

Q81

A DOI：10.11967/ 2017150209

山东省自然科学基金（批准号：ZR2012BQ009）

王珊珊(1983-02)，女，副研究员，博士。联系人：陈相峰，副研究员，电话：0531-82605340，E-mail：xiangfchensdas@163.com.