半月板损伤并发膝关节滑膜炎患者局部滑膜组织及滑液中基质金属蛋白酶3、9、13的表达观察

黄媛霞，李爱国，陶金刚，徐海斌，路坦

(新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100)

半月板损伤并发膝关节滑膜炎患者局部滑膜组织及滑液中基质金属蛋白酶3、9、13的表达观察

黄媛霞，李爱国，陶金刚，徐海斌，路坦

(新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100)

目的 观察半月板损伤导致的滑膜炎患者滑膜滑液中基质金属蛋白酶3(MMP-3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达变化。方法 128例半月板损伤患者，根据是否有伴有滑膜炎分为半月板损伤诱发滑膜炎者81例(观察组)和单纯半月板损伤者47例(对照组)。分别采用荧光定量PCR法和免疫组化法检测两组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白，采用ELISA法检测两组滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13。结果 观察组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA相对表达量分别为3.12±0.41、2.10±0.24、3.01±0.30，对照组分别为1.53±0.35、0.87±0.18、1.12±0.21,P均<0.05；观察组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 蛋白相对表达量分别为394.1±20.6、170.5±14.8、190.7±13.6，对照组分别为204.5±15.3、90.3±8.4、109.3±10.4,P均<0.05。观察组滑液组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA相对表达量分别为12.5±2.1、15.7±2.4、9.5±1.9，对照组分别为19.4±2.6、17.5±2.3、14.7±2.4,P均<0.05。观察组Ayral滑膜炎评分≤60分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平明显低于Ayral滑膜炎评分>60分者(P<0.05)。结论 半月板损伤导致的滑膜炎患者滑膜、滑液存在MMP-3、MMP-9和MMP-13 高表达。MMP-3、MMP-9和MMP-13的异常表达可能与半月板损伤滑膜炎的发生有关。

滑膜炎；半月板损伤；基质金属蛋白酶3；基质金属蛋白酶9；基质金属蛋白酶13

膝关节是人体重要关节，半月板可分散关节软骨载荷、协助关节滑液润滑关节，保护关节软骨，增强关节稳定性[1,2]。外力可导致膝关节在运动的同时发生破裂和旋转，造成半月板损伤。半月板损伤是常见的膝关节病变，可导致膝关节屈伸功能异常。长时间半月板损伤可导致半月板周围的膝关节软骨发生病变，最常见的为滑膜炎。半月板损伤所致滑膜炎主要临床表现为滑膜组织充血水肿，关节滑液增多并伴有关节周围疼痛肿胀。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组金属依赖的可降解细胞外基质的蛋白酶类。研究发现，MMPs与基质金属蛋白酶组织抑制因子比例失衡可能导致细胞外基质降解异常[3,4]。基质金属蛋白酶3(MMP-3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)在关节软骨降解中发挥重要作用[5,6]，可破坏降解蛋白聚糖而保持关节软骨弹性[7]。正常生理条件下，MMPs与基质金属蛋白抑制物相互制约相互平衡,维持软骨结构的完整性。但半月板损伤导致的滑膜炎患者病变组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达变化目前尚未见相关报道。我们观察了半月板损伤导致的滑膜炎患者滑膜滑液中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院于2013年6月～2016年6月收治的半月板损伤的128例患者，均经磁共振成像或者关节镜下检查确诊为半月板损伤。128例患者分为半月板损伤诱发滑膜炎者81例(观察组)和单纯半月板损伤者47例(对照组)。观察组中男49例，女32例；年龄46～77(52.5±12.3)岁；其中右膝41例，左膝40例；病程(3.7±1.1)年；关节镜下损伤部位及类型：前1/3处20例(横裂9例，纵裂5例，斜裂2例，层裂2例，复合裂2例)；中1/3处39例(横裂15例，纵裂12例，斜裂6例，层裂3例，复合裂3例)；后1/3处22例(横裂10例，纵裂4例，斜裂3例，层裂3例，复合裂2例)；采用Ayral的方法进行评定[8]，Ayral滑膜炎评分≤60分者49例、>60分者32例。对照组中男27例，女20例；年龄45～75(54.1±10.2)岁；其中右膝22例，左膝25例；病程(3.2±1.0)年；关节镜下损伤部位及类型：前1/3出11例(横裂4例，纵裂3例，斜裂1例，层裂1例，复合裂1例)；中1/3处20例(横裂6例，纵裂7例，斜裂3例，层裂2例，复合裂2例)；后1/3处16例(横裂5例，纵裂5例，斜裂2例，层裂2例，复合裂2例)；Ayral滑膜炎评分为≤60者28例、>60者19例。两组年龄、性别比例、病程、损伤部位及损伤类型等临床资料具有可比性。

1.2 试剂及仪器 实时荧光定量2×SYBR Green Mix和逆转录试剂盒均购自南京唯赞生物有限公司；引物有上海英俊生物有限公司合成；MMP-3、MMP-9和MMP-13 ELISA检测试剂盒均购自R&D公司；鼠抗人MMP-3、MMP-9和MMP-13抗体均购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的羊抗鼠二抗均购自杭州华安生物有限公司；DAB显色液购自上海生工生物有限公司；显微镜购自日本奥林巴斯生物有限公司，其他试剂均为国产分析纯试剂，购自国药集团。

1.3 两组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白检测 ①荧光定量PCR法检测两组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA：取两组滑膜组织，液氮研磨组织，RNA提取试剂盒提取总RNA，分光光度计测定RNA水平，逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以GAPDH为内参， MMP-3上游引物为5′- ACCCAAATGGAGGAAAAACC-3′, 下游引物5′- CTTCAGCATTGGCTGAGTGA-3′； MMP-9上游引物为5′- TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′,下游引物5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′；MMP-13上游引物为5′- GTCTCTCCTTCCCAGGGC -3′,下游引物5′- TTG ACCATGGGGCTAGAA -3′；GAPDH上游引物为5′- TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，下游引物5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。反应体系： 2×SbGreen RT-PCR Mix 25 μL，FGF5-F1 1 μL， FGF5-R1 1 μL，cDNA 1 μL，加水补至50 μL。反应条件为94 ℃预性 5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，40个循环，以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。②免疫组化法检测两组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 ：取两组滑膜组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，脱蜡、水化，滴加0.3%的过氧化氢-甲醇溶液，混合30 min以消除内源性过氧化物酶的影响，PBS洗涤3次，每次5 min，再用PBS稀释的10%的山羊血清封闭 1 h，封闭液分别稀释MMP-3、MMP-9和MMP-13一抗，滴于玻片上，4 ℃孵育12 h，PBS洗涤3次，每次5 min，再用封闭液稀释HRP标记的二抗，滴于玻片上室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，DAB显色，脱水、封片并拍照，采用软件对图片进行分析。两组滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13检测 采用ELISA法检测两组滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13。所有操作均严格按照使用说明书进行。设计校正孔，添加反应时只加TMB显色液和终止液。分别取两组滑液标本，每孔100 μL加入相应孔中，室温孵育120 min，洗液洗涤3次，每次5 min；最后一次用纸吸干液体，加入稀释后的一抗，室温孵育3 h,PBS洗涤3次，每次5 min，加入稀释好HRP标记的羊抗鼠的二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤3次、每次5 min。加入100 μL DAB显色液，37 ℃孵育20 min，液体颜色变化后加入1 mol/L浓硫酸终止反应。采用酶标仪测定每孔的在480 nm处的吸光度值。根据吸光值建立标准曲线，根据标准曲线建立方程，计算MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白的相对表达量。

2 结果

两组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相对表达量比较见表1。

表1 两组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，#P<0.05。

两组滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比较见表2。

观察组不同Ayral滑膜炎评分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比较见表3。

3 讨论

表2 两组滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比较

注：与对照组比较，#P<0.05。

表3 观察组不同Ayral滑膜炎评分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比较

注：与Ayral滑膜炎评分≤60者比较，#P<0.05。

半月板损伤是临床常见的膝关节病变，长时间半月板损伤可导致滑膜炎，导致膝关节出现水肿和疼痛等症状，严重影响患者生活质量。目前临床主要通过关节镜诊断半月板损伤所致滑膜炎，但关节镜是一种创伤性诊断方法。因此，寻找一种快速有效诊断滑膜炎的指标具有重要临床意义。滑膜是关节囊的内层，其主要包括两部分，分别为内衬层，由1～4层滑膜细胞组成，具有吞噬能力。另一部分为基底层[9]。研究发现滑膜具有分泌和吞噬功能，其分泌的滑液不仅对关节具有润滑作用，而且具有营养关节的功能[10]。但关节滑膜一旦发生感染，滑膜会分泌大量的炎症介质进入滑液，因此滑液诊断滑膜和关节病变的敏感性较高。

MMPs是一组金属依赖的可降解细胞外基质的蛋白酶类,其在关节软骨细胞外基质的代谢过程中发挥重要作用[11]。MMP-3是基质金属蛋白酶家族成员之一，由软骨细胞、滑膜细胞分泌，不仅能降解多种细胞外基质中的细胞外蛋白多糖等基质蛋白底物，更重要的是MMP-3可激活MMP-9和MMP-13等酶原产生级联放大反应，加重软骨破坏程度[12]。MMP-9在可破坏软骨基质，暴露软骨组织胶原，破坏胶原形成的网状结构[13]。MMP-9破坏胶原后产生的胶原网状结构为进一步降解提供了基础。因此MMP-3和MMP-9的相互作用加速了胶原网状结构破坏，导致胶原软骨发生不可逆的改变。MMP-13的主要生物学作用是介导Ⅱ型胶原降解[14]。

本研究结果发现，观察组滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组。说明半月板损伤引起的滑膜炎滑膜组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13表达水平升高，而MMP-3、MMP-9和MMP-13表达水平的增加可能导致基质金属蛋白酶和基质金属抑制物失衡，最终使关节软骨破坏受损。进一步分析显示观察组滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13的水平高于对照组。进一步证实观察组关节滑膜组织和滑液中存在MMPs表达水平上调，打破了关节软骨基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制物的平衡，使软骨组织损伤。说明MMP-3、MMP-9和MMP-13水平随着Ayral滑膜炎评分增加而升高，可能与滑膜炎病变程度成正相关。

综上所述，半月板损伤导致的滑膜炎患者滑膜、滑液存在MMP-3、MMP-9和MMP-13 高表达。MMP-3、MMP-9和MMP-13的异常表达可能与半月板损伤滑膜炎的发生发展有关。

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河南省医学科技攻关计划项目(豫卫科201304029)。

徐海斌(E-mail: nhoscn@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.029

R684.7

B

1002-266X(2017)19-0091-03

2016-08-30)