宫颈癌组织中p16蛋白、线粒体融合蛋白2的表达变化

李昌红,车玲玉,程振辉,孙鑫,白云

(华北理工大学生命科学学院，河北唐山063000)

宫颈癌组织中p16蛋白、线粒体融合蛋白2的表达变化

李昌红,车玲玉,程振辉,孙鑫,白云

(华北理工大学生命科学学院，河北唐山063000)

目的 观察宫颈癌组织中抑癌基因p16和线粒体融合蛋白2(HSG)的表达变化。方法 采用免疫组织化学的方法检测72例宫颈癌组织、51例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织(其中CINⅠ级27例、CINⅡ级10例、CINⅢ级14例)、25例正常宫颈组织中p16和HSG的表达。结果 宫颈癌组织、CINⅠ组织、CINⅡ组织、CIN Ⅲ组织、正常宫颈组织中p16的阳性表达率分别为91.67%(66/72)、22.22%(6/27)、60.00%(6/10)、64.28%(9/14)、20.00%(5/25)；宫颈癌组织中p16的阳性表达率均高于CIN宫颈组织、正常宫颈组织(P均<0.05)。宫颈癌组织、CINⅠ组织、CINⅡ组织、CIN Ⅲ组织、正常宫颈组织中HSG的阳性表达率分别为 8.3%(6/72)、44.44%(12/27)、40.00%(4/10)、35.7%(5/14)、60.00%(15/25)；宫颈癌组织中HSG阳性表达率低于CINⅠ组织、CINⅡ组织、CIN Ⅲ组织、正常宫颈组织(P均<0.05)。p16表达与宫颈癌分化程度有关(P<0.05); HSG表达与宫颈癌临床分期、分化程度有关(P均<0.05),与患者年龄、淋巴结转移情况及病理类型无关(P均>0.05)。相关性分析显示，宫颈癌组织p16表达与HSG的表达呈负相关(r=-0.464，P<0.05)。结论 宫颈癌组织中p16阳性表达率降低，HSG阳性表达率升高。p16、HSG的异常表达可能与宫颈癌的发生发展有关。

宫颈肿瘤；宫颈癌；多肿瘤抑癌基因；细胞增殖抑制基因

宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一[1]。p16又称多肿瘤抑制基因，是被发现的第一个可直接作用于细胞周期参与细胞周期调控，控制细胞生长与分化并抑制细胞分裂的基因[2]。p16是细胞周期中的一种抑癌基因，能直接参与细胞周期的调控并负责调节细胞增殖与分裂，在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达。细胞增殖抑制基因HSG,又称为线粒体融合蛋白2，既往研究发现，它可以使细胞周期停滞在G0/G期，诱导细胞凋亡；并且能抑制ras蛋白，调节ERK/MARP路径，从而遏制肿瘤细胞快速增殖[3，4]。目前，国内外关于p16、HSG在宫颈癌中的相关研究报道较少。我们观察了宫颈癌组织中p16、HSG的表达变化，探讨p16、HSG在宫颈癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 宫颈病变组织标本来源 收集2011年7月～2016年7月华北理工大学附属医院妇科手术切除的宫颈癌组织标本72例、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ27例、CINⅡ10例，CINⅢ 14例、正常宫颈组织标本25例。宫颈癌患者中年龄(48.8±2.6 )岁，将宫颈癌患者年龄按照FIGO分期标准分为 Ⅰ期32例，Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期21例。四类标本来源与患者年龄等临床资料差异无统计学意义。

1.2 试剂与仪器 鼠抗人p16基因单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ,兔抗人HSG基因单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP-9001免疫组化染色试剂盒、DAB显色剂及枸橼酸盐购自北京中杉金桥生物技术有限公司，华北理工大学提供Olympus光学显微镜。

1.3 宫颈癌组织中p16、HSG蛋白检测方法 采用免疫组化方法。将标本制成3 μm石蜡切片，对脱蜡完全的标本进行抗原修复，暴露抗原决定簇；过氧化氢溶液除去内源性氧化酶，解除内源物质对实验的干扰；滴加一抗和HSG，4 ℃冰箱过夜。将5 μL p16与1 000 μL的稀释液均匀混合配制成通用二抗(p16)，4 ℃冰箱过夜。DAB显色剂进行显色操作，用蒸馏水洗去DAB显色剂，然后进行脱水，脱水后风干，中性树脂封片，封片完成后在显微镜下观察。p16阳性表达定位于细胞核及细胞质中，呈深黄色大颗粒。p16在细胞核及细胞质处深黄色大颗粒为阳性；HSG阳性表达定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒。HSG在细胞质中呈现出棕黄色颗粒则为阳性。计算阳性细胞百分比：>60%为强阳性，10%～60%为阳性，<10%为弱阳性，未发现阳性细胞为阴性，强阳性与弱阳性均判定为蛋白表达阳性。

1. 4 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman等级相关分析法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织、CIN组织、正常宫颈组织中p16和HSG蛋白的表达变化 宫颈癌组织、CINⅠ组织、CINⅡ组织、CIN Ⅲ组织、正常宫颈组织中p16阳性表达率分别为91.67%(66/72)、22.22%(6/27)、60.00%(6/10)、64.28%(9/14)、20.00%(5/25)；宫颈癌组织中p16阳性表达率均高于CIN宫颈组织、正常宫颈组织(P均<0.05)。宫颈癌组织、CINⅠ组织、CINⅡ组织、CIN Ⅲ组织、正常宫颈组织中HSG的阳性表达率分别为 8.3%(6/72)、44.44%(12/27)、40.00%(4/10)、35.7%(5/14)、60.00%(15/25)；宫颈癌组织中HSG阳性表达率低于CINⅠ组织、CINⅡ组织、CIN Ⅲ组织、正常宫颈组织(P均<0.05)。

2.2 p16、HSG表达与宫颈癌临床病理参数的关系 p16表达与宫颈癌分化程度有关(P<0.05); HSG表达与宫颈癌临床分期、分化程度有关(P均<0.05),与患者年龄、淋巴结转移情况及病理类型无关(P均>0.05)。见表1。

表1 p16 、HSG表达与宫颈癌临床病理参数的关系(例)

2.3 宫颈癌组织 p16、HSG表达的相关性 相关性分析显示，宫颈癌组织p16表达与HSG的表达呈负相关(r=-0.464,P<0.05)。

3 讨论

宫颈癌是危害妇女健康的第二大肿瘤，死亡率位居女性恶性肿瘤的首位，同时也是女性癌症的第二大死亡原因[9]。宫颈癌的发生发展过程是非常复杂的，它与细胞周期的调节失控有关，也与多种抑癌基因的表达以及细胞凋亡的参与密切相关。

p16是1994年美国冷泉港实验室Kamb等科学家发现的一种新的抗癌基因[10]，定位于人类染色体9p21上;由2个内含子及3个外显子组成，第1外显子由126 bp组成，第2外显子由307 bp组成，第3外显子11 bp组成。该基因是细胞周期中的一种基本基因和细胞周期调节蛋白之一，它可阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞增殖；p16基因的表达产物(即p16蛋白)直接参于细胞增殖的负调节并定位于细胞核内。据之前的研究表明p16可能是比P53更重要的一种新型抗癌基因。有人把p16基因比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖[11]，便可能导致恶性肿瘤发生。发生突变或缺失时，通常极易导致细胞异常增殖[11]，形成肿瘤。p16基因直接参与肿瘤的形成，目前已经分别在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现p16基因发生突变，这提示p16基因以缺失、突变方式广泛参予肿瘤形成[12]。因此，检测p16基因的突变与缺失，是判断宫颈组织是否有肿瘤以及推断肿瘤的部分性质的一项重要指标；对于宫颈癌的预后诊断及临床治疗更是具有极其重要的现实意义。

本研究发现，宫颈癌组织中p16阳性表达率降低。p16的表达与宫颈癌组织分化程度有关；这说明p16基因的表达水平越高，肿瘤组织分化程度越严重[13]；这也提示p16基因的表达上调与宫颈癌的进展密切相关，且能够参与并调节生物体多种生理病理过程：具有促进肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖的作用；能够通过使癌变细胞的细胞周期停留在G0/G期，而诱导细胞凋亡。本研究结果显示，HSG在宫颈癌组织中的表达量明显低于在正常宫颈组织里和良性肿瘤组织当中。在临床分期和分化中，p16表达量与其发展程度呈负相关；且有淋巴结转移组的表达量低于无淋巴结转移组。这即证明HSG的表达量越低，肿瘤组织发展就越慢；即HSG能较有效地抑制恶性肿瘤细胞进而削弱癌细胞对周围组织的浸润作用。以上结果都充分表明了HSG是一种潜在的抑癌基因，具有抗肿瘤效应[14]。它也是一种潜在的生物标志物，其在细胞信号转导、能量代谢、增殖及调亡等生理或病理性过程中具有重要的调节作用；并且HSG基因与宫颈癌的不良预后也有着密切的相关性。因此它亦能够作为评估宫颈癌病情进展和预后的指标之一。

HSG是具有抑制细胞增殖作用的融合蛋白，并且也是一种高度保守的跨膜GTP酶。它在细胞信号转导、能量代谢、细胞增殖以及细胞凋亡等多种生命过程中均具有重要的调节作用；对于多种肿瘤传代细胞系同样具有抗增殖和诱导其凋亡的作用。HSG可以使分裂细胞的细胞周期在G0/G1期停止然后诱导相对应的细胞凋亡，该基因在肿瘤中的作用是通过促进肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖[15]。

本研究中，宫颈癌组织p16表达与HSG的表达呈负相关。可能原因为，在宫颈癌发生发展过程中， p16可直接作用于细胞周期，肿瘤组织中p16的表达情况可作为宫颈癌恶性程度的指标[16]。p16在宫颈组织中的表达特点提高了宫颈癌的早期诊断、预后判断的准确率,并且也为肿瘤的基因治疗提供理论依据[17]。HSG则是一种潜在的抑癌基因，具有较强的抗肿瘤效应[18],能抑制肿瘤细胞的增殖,降低肿瘤细胞的浸润能力。

综上所述，宫颈癌组织中p16阳性表达率降低，HSG阳性表达率升高。p16、HSG的异常表达可能与宫颈癌的发生发展有关。p16、HSG可能作为宫颈癌诊断和预后判断的参考指标，提高对官颈癌诊断的灵敏度[19]和预后判断的准确率[20]。但p16、HSG在宫颈癌组织中相互作用的具体机制尚有待于进一步研究。

[1] Li PT, Zhu SY, Wu XP, et al.Association of Polymorphisms inMitofusin-2 Gene with Type 2 Diabetes in Han Chinese[J] . Bio Med Res Inter, 2012，42(7)：1-7.

[2] 郭建华，伍亚云，刘俊宏.p53、p16和C-myc基因表达在宫颈癌早期诊断中的价值[J].现代中西医结合杂志，2013，22(23)：2518-2523．

[3] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwisde burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008 [J]. Inter Jour Cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

[4] 雷蕾，叶斌，王西川,等. P16基因、p53和Ki67在宫颈癌中的表达及其临床意义 [J]. 实用医院临床杂志,2014,11(4):123-126.

[5] Wang Z，Liu Y，Liu J，et al．HSG /Mfn2 gene polymorphism and essential hypertension; a case-control association study inChinese[J]． J Atheroscler Thromb，2011，18(1) : 24-31．

[6] 刘爽，李亚里，刘爱军，等 .P16( INK4A)及 Ki-67 在宫颈腺癌组织中的表达及意义[J]. 解放军医学杂志，2012,15(3)：225-228.

[7] Snijders PJ，Steenbergen RD，Heideman DA，et al． HPV media-ted cervical carcinogenesis: concepts and clinical implications[J]． J Pathol， 2006，208(2):152-164．

[8] Zhang GE， Jin HL， Lin XK,et al. Anti-Tumor Effects of Mfn2 in Gastric Cancer[J]. Mole Sci, 2013,14(7)：13005-13021

[9]Deng XJ，Wu HG. The expression and its clinical significance of Ki67 and PTEN in ovarian serous tumor[J]. Pract Jour Cancer， 2011，26(4):365-371．

[10] 董静茹，李丽，潘龙.CEA、P16、Ki-67 在原发宫颈腺癌中的表达及意义[J]. 中国实用医药，2014，19(13)：50-51.

[11]徐秋霞，关红琼. P16基因INK4A、p14AR和Ki67在宫颈癌中的表达特点[J].海南医学院学报，2010,16(1)：17-19.

[12] 卢伟，雷春燕. P16和磷酸化蛋白激酶B在宫颈癌和宫颈病变组织中的表达[J]. 内蒙古医学杂志,2010,4 (3):303-305.

[13] 陈悦，张晓薇，邓志校，等．P16基因表达与宫颈癌预后相关性分析[J]．实用医学杂志,2014，30(15)：2417-2419．

[14] David M, Smalley G, Nicholas E，et al． Isolation and identification of potential urinary microparticle biomarkers of bladder cancer[J]． J Proteome Res， 2008，7(5):2089-2096.

[15] 章培,涂媛,李钒,等. REGγ 和P16基因 在乳腺癌中的表达及意义[J]. 四川医学，2015,7(36):941-943.

[16] 郭周庆,陈光辉,吴又明，等. TCT结合DNA定量及Ki67 P16基因免疫组化联合对宫颈癌及其癌前病早期筛查的应用研究[J]. 国际医药卫生导报，2015,21(2):180-183.

[17] 周莉，孔敏，李海霞，等. P16基因在宫颈癌组织中的表达及临床意义[J]. 中国实验诊断学, 2013, 17(9): 1614-1616.

[18] 杨伟洪,钟守军,段立峰,等.P16基因、ER、CEA在宫颈腺癌和子宫内膜癌别诊断中的临床意义[J]. 中国医学创新，2015,12(18): 36-38.

[19] 刘嵘，濮德敏，祝达，等. uPA、Ki67和VEGF在宫颈癌组织中的表达及相关性研究[J].华中科技大学学报，2014,43(5)：516-519.

[20] 李昌红，白云，车玲玉，等. 宫颈癌组织中HSG，Ki67表达观察[J].山东医药， 2016,56(27)：82-84.

河北省卫生计生委医学科学研究重点课题计划(20170894)；华北理工大学2017年大学生创新计划项目(20170897);华北理工大学2017年大学生创新创业训练计划立项项目(X2017189)。

白云(E-mail: 1063628881@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.015

R737.33

B

1002-266X(2017)19-0051-03

2016-11-17)