超高压处理对消减乳源酪蛋白抗原性影响的体外模拟研究

曲志华,张小强,*,周亚盼,梁晓瑜,张 妍,王 旭,刘 静

(1.东南大学公共卫生学院,江苏南京 210009; 2.东南大学环境医学工程教育部重点实验室,江苏南京 210009)

超高压处理对消减乳源酪蛋白抗原性影响的体外模拟研究

曲志华1,2,张小强1,2,*,周亚盼1,2,梁晓瑜1,2,张 妍1,2,王 旭1,2,刘 静1,2

(1.东南大学公共卫生学院,江苏南京 210009; 2.东南大学环境医学工程教育部重点实验室,江苏南京 210009)

目的:研究超高压结合不同模拟胃肠消化对于消减乳源酪蛋白抗原性的影响。方法:以乳源酪蛋白为研究对象,采用不同的压力、温度、保压时间、超高压次数来处理酪蛋白,并对处理后的酪蛋白进行模拟成人、婴儿胃肠消化,用间接酶联免疫吸附法来检测经过处理后酪蛋白过敏原消减效果,并且使用正交设计确定消减酪蛋白过敏原最优处理条件组合。结果:在相同超高压处理条件下,对酪蛋白进行模拟成人、婴儿胃肠消化环境,其结果显示成人比婴儿胃肠消化后酪蛋白过敏原消减的效果更好;高压结合模拟成人胃肠消化的最佳条件组合是:350 MPa、温度30 ℃、保压时间15 min、高压3次,抑制率为22.67%;高压结合模拟婴儿胃肠消化的最佳条件组合是:350 MPa、温度30 ℃、保压时间20 min、高压1次,抑制率为39.95%。结论:高压结合不同胃肠消化后都可以消减酪蛋白过敏反应,而且结合成人胃肠消化比结合婴儿胃肠消化对过敏原的消减效果更好。

乳源酪蛋白,超高压结合胃肠消化,过敏原消减,酶联免疫

酪蛋白是牛奶中主要的蛋白之一,其消化后能产生许多具有生理功能的活性肽,如阿片样肽、阿片样拮抗肽、血管紧张素转化酶抑制肽、免疫调节肽、抗菌肽、抗血栓肽、矿物元素结合肽等[1],除此之外,近几年还发现抗炎肽[2-3],这些成分的发现无疑是有益于人们的健康的。但是酪蛋白是导致婴幼儿牛奶过敏主要的过敏原之一[4-5],其主要的临床表现为皮肤症状,如荨麻疹、血管神经性水肿、湿疹;其次是胃肠道表现,如血丝便、拒食[6-7]。因此,降低酪蛋白的过敏反应具有重要意义。

研究表明,酶水解酪蛋白及其亚型可以降低酪蛋白抗原反应[8-9],并且不同的蛋白酶对于酪蛋白抗原性影响不同[10]。超高压技术具有降低食品致敏性的作用[11-12]。研究表明,超高压对虾过敏原蛋白有消减作用,经过超高压处理的虾与煮沸虾相比,其结合IgE的能力降低了73.59%[13],先高压再水解和超高压下直接酶处理对过敏原的消减效果更好[14]。超高压可以降低婴儿配方大豆分离蛋白的致敏性,与未处理组相比其在300 MPa、15 min的条件下大豆分离蛋白的变应原性降低了48.6%[15]。超高压处理鱿鱼,可以减少IgE和IgG与抗原表位的结合,降低其过敏反应,并且两次循环超高压可以引起有意义的降低[16]。基于以上研究思路和背景,采用多次超高压处理技术,结合适合的压力、温度、保压时间、高压次数来处理酪蛋白,并体外模拟消化、探讨酪蛋白在不同条件下过敏性反应的情况,同时采用正交实验设计得到降低酪蛋白过敏的最佳高压次数、压力、时间、温度组合,对消减乳源酪蛋白抗原性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酪蛋白 美国Sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶 南京生兴生物技术有限公司;兔抗酪蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG 英国Abcam公司;脱脂奶粉 美国BD公司;吐温-20 美国Amresco公司;TMB显色液(ELISA HRP显色专用) 碧云天生物公司;三羟甲基氨基甲烷 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;浓盐酸、NaOH等均为分析纯。

S-IL-100-850-9-W超高压处理系统 英国SFP公司;RT-6000酶标分析仪 美国Rayto公司;PH计 上海精密科学仪器有限公司;智能生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司;无菌采样袋(12 cm×18 cm) 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超高压处理酪蛋白 称取100 mg酪蛋白加入10 mL pH8.0的Tris-HCl缓冲液混合均匀,密封于无菌采样袋中(不留气泡),将其放入超高压设备中,并完全浸没于传压介质中,高压后的样品立即放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.1 不同的压力处理乳源酪蛋白 施压温度为25 ℃,保压时间为20 min,高压次数1次,分别选取100、200、300、400 MPa的压力条件处理乳源酪蛋白。

1.2.1.2 不同的施压温度处理乳源酪蛋白 处理压力为200 MPa,保压时间为20 min,高压次数1次,分别选取15、25、35、45 ℃的温度条件来处理乳源酪蛋白。

1.2.1.3 不同的保压时间处理乳源酪蛋白 处理压力为200 MPa,施压温度是25 ℃,高压次数1次,分别选取10、20、30、40 min的保压时间处理乳源酪蛋白。

1.2.1.4 不同的高压次数处理乳源酪蛋白 处理压力为200 MPa,施压温度是25 ℃,保压时间是20 min,分别选取1、2、3次的高压次数来处理乳源酪蛋白。

1.2.1.5 超高压处理乳源酪蛋白的条件优化 选取处理压力、施压温度、保压时间和高压次数作为实验因素,正交实验设计见表1。

表1 超高压处理乳源酪蛋白正交实验因素水平表

1.2.2 模拟不同的胃肠消化实验 模拟成人胃肠消化实验:将高压处理后的乳源酪蛋白,用0.2 mol/L HCl调节pH至2.0,在37 ℃恒温水浴锅中预热,加入胃蛋白酶4 mg,恒温消化2 h;然后用0.2 mol/L NaOH调节样液pH至7.5,添加4 mg胰蛋白酶,放入37 ℃恒温水浴锅中,恒温消化4 h。最后100 ℃沸水浴灭活10 min,4000 r/min离心10 min,放入-4 ℃冰箱保存[17]。

模拟婴儿胃肠消化实验:将高压处理后的乳源酪蛋白,用0.2 mol/L HCl调节pH至3.0,在37 ℃恒温水浴锅中预热,加入胃蛋白酶4 mg,恒温消化2 h;然后用0.2 mol/L NaOH调节样液pH至7.0,添加4 mg胰蛋白酶,放入37 ℃恒温水浴锅中,恒温消化4 h。最后100 ℃沸水浴灭活10 min,4000 r/min离心10 min,放入-4 ℃冰箱保存[18-19]。

1.2.3 乳源酪蛋白水解物抗原性的测定 间接竞争Elisa法:将未处理抗原包被96孔酶标板,设置空白对照组,放入冰箱4 ℃过夜;用5 g/100 mL封闭液37 ℃封闭2 h,PBST洗板后加入1∶5000稀释的单克隆抗体和稀释50倍的待测抗原,37 ℃竞争反应2 h;再次洗板后加入1∶100000 HRP标记的二抗,37 ℃竞争反应1 h;洗板后加入TMB显色液显色,用酶标仪测定波长370 nm处的吸光度。抗原水平抑制率计算公式:

图1 不同因素对乳源酪蛋白过敏原消减作用的影响Fig.1 Effects of different factors on casein from bovine milk allergen elimination注:*表示数据与对照组相比有显著性差异,图2同。

抑制率(%)=(1-B/B0)×100=(OD空白对照-OD待测样品)/OD空白对照×100

2 结果与分析

2.1 超高压结合模拟成人胃肠消化的单因素实验

2.1.1 高压条件单因素实验 在对乳源酪蛋白进行超高压处理时,控制其压力、温度、时间、次数,并结合模拟成人胃肠消化,其过敏原消减结果如图1:

压力条件对于酪蛋白过敏原消减的影响如图1A:压力为100、200、300、400 MPa与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且压力在300 MPa时,过敏原消减最为显著。

温度条件对于酪蛋白过敏原消减的影响如图1B:温度为15、25、35、45 ℃与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且温度在25 ℃的条件下,过敏原消减最为显著。

保压时间对于酪蛋白过敏原消减的影响如图1C:与对照组相比,保压时间为10、20、30、40 min时,抗原性显著降低(p<0.05),且保压时间20 min时,过敏原消减最为显著。

高压次数对于酪蛋白过敏原消减的影响如图1D:高压次数为1、2、3次与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且高压次数为3次时,过敏原消减最为显著。

酪蛋白抗原性的减弱或增强可能是由于压力、超高压与热处理共同作用、保压时间、高压循环次数的变化,酪蛋白的结构发生变化,使存在于酪蛋白抗原表面的表位被掩盖或破坏,或是原包埋的酪蛋白分子内部的抗原表位被暴露,形成新的抗原表位[11,20-21]。

2.1.2 正交实验结果 由表2可知,通过高压处理乳源酪蛋白,结合模拟成人胃肠消化所得产物,经过间接酶联免疫法检测,得出4种因素对酪蛋白抗原性的影响大小为A>B>C>D,即压力>温度>保压时间>高压次数,较好的实验方案为A3B3C1D3,即压力350 MPa、温度30 ℃、保压时间15 min、高压次数3次,此条件下的抑制率为22.67%。与对照组相比其酪蛋白过敏原消减情况已经有了很大程度的降低,说明超高压技术结合成人胃肠消化对于酪蛋白过敏原的消减起到一定的作用。

表2 高压处理结合模拟成人胃肠消化对过敏原消减效果的正交实验研究±s)

图2 不同条件下乳源酪蛋白过敏原消减作用Fig.2 Casein from bovine milk allergen elimination under different conditions

2.2 超高压结合模拟婴儿胃肠消化的单因素实验

2.2.1 高压条件单因素实验 在对乳源酪蛋白进行超高压处理时,控制其压力、温度、时间、次数,并结合模拟婴儿胃肠消化,其过敏原消减结果如图2所示。

压力条件对于酪蛋白过敏原消减的影响如图2A:当压力为200、300 MPa时，与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且压力在300 MPa时,过敏原消减最为显著。

温度条件对于酪蛋白过敏原消减的影响如图2B:温度在15、25 ℃时与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且温度在25 ℃的条件下,过敏原消减最为显著。

保压时间对于酪蛋白过敏原消减的影响如图2C:保压时间20、30 min与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且保压时间在20 min时,过敏原消减最为显著。

高压次数对于酪蛋白过敏原消减的影响如图2D:高压次数1、2、3次与对照组相比,其抗原性显著降低(p<0.05),且高压次数为3次时,过敏原消减最为显著。

酪蛋白抗原性的减弱,可能是由于压力、温压结合、保压时间、高压循环次数的变化,破坏酪蛋白的空间结构,进而可以破坏蛋白的构象性表位,导致其抗原性降低[22],而酪蛋白抗原性的增加可能是由于,破坏维持酪蛋白构象的作用力,使酪蛋白结构伸展,暴露更多的芳香族和疏水性氨基酸残基,使被掩盖的抗原表位重新暴露到蛋白结构上面,增加抗原抗体的结合[23]。

2.2.2 正交实验结果 由表2可知,通过高压处理乳源酪蛋白,结合模拟婴儿胃肠消化所得产物,经过间接酶联免疫法检测,得出4种因素对酪蛋白抗原性的影响大小为A>B>D>C,即压力>温度>高压循环次数>保压时间,较好的实验方案为A3B3C2D1,即压力350 MPa、温度30 ℃、保压时间20 min、高压次数1次,此条件下的抑制率为39.95%。与对照组相比其酪蛋白过敏原消减情况已经有了很大程度的降低,说明超高压技术结合婴儿胃肠消化对于酪蛋白过敏原的消减起到一定的作用。

表3 高压处理结合模拟婴儿胃肠消化对过敏原消减效果的正交实验研究±s)

3 结论

在相同超高压处理条件下,对酪蛋白进行模拟成人、婴儿胃肠消化环境,在单因素基础上应用正交设计对超高压处理酪蛋白条件进行优化。单因素结果显示:超高压结合成人、婴儿胃肠消化后都可以消减酪蛋白过敏反应。高压结合模拟成人胃肠消化的最佳条件组合是:350 MPa、温度30 ℃、保压时间15 min、高压3次,此时的抑制率为22.67%;高压结合模拟婴儿胃肠消化的最佳条件组合是:350 MPa、温度30 ℃、保压时间20 min、高压1次,此时的抑制率为39.95%,因此可以看出:结合成人胃肠消化比结合婴儿胃肠消化对过敏原的消减效果更好。期望通过本研究,可以进一步对牛奶中酪蛋白过敏原进行消减,研发出更利于婴儿饮用的液态奶以及其低过敏性酪蛋白相关产品。

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Imitative study on the effects of ultra high pressure treatment on the elimination of allergens from bovine caseininvitro

QU Zhi-hua1,2,ZHANG Xiao-qiag1,2,*,ZHOU Ya-pan1,2, LIANG Xiao-yu1,2,ZHANG Yan1,2,WANG Xu1,2,LIU Jing1,2

(1.School of Public Health,Southeast University,Nanjing 210009,China; 2.Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education,Southeast University,Nanjing 210009,China)

Objective:The effects of ultra high pressure(UHP)treatment on elimination of allergens in casein from bovine milk were studied by gastrointestinal digestion models. Method:Casein from bovine milk were pretreated at different pressure level,temperature,pressure dwell time and pressure cycle,following by digested at the imitative condition of adult or infant gastrointestinal environment,respectively. The eliminating effectiveness of allergens was detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Orthogonal array design were used to optimize the operating conditions. Result:After the same UHP treatment,the bovine casein was digested in an imitative adult or infant gastrointestinal environment,respetively.The results showed that casein allergen reduction in adult gastrointestinal digestive models was better than in infant’s. The optimal UHP combined with adult gastrointestinal digestive models treatment was performed at the condition of 350 MPa,30 ℃,15 min,3 times cycle,and the inhibition rate was 22.67%. The optimal UHP combined with infant gastrointestinal digestive models treatment was performed at the condition of 350 MPa,30 ℃,20 min,1 times cycle,and the inhibition rate was 39.95%. Conclusion:These results demonstrated that UHP treatment followed by adult and infant gastrointestinal digestion had eliminating effect on allergens in casein from bovine milk,and UHP treatment combined with adult gastrointestinal digestion model was more effective in elimination allergens in casein from bovine milk.

casein from bovine milk;ultra high pressure combined gastrointestinal digestion models;allergen elimination;ELISA

2016-12-06

曲志华(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：功能食品研究，E-mail：annaqu198997@163.com。

*通讯作者:张小强(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：功能食品研究，E-mail：zhangxq7843@126.com。

中央高校基本科研业务费专项资金资助和江苏省普通高校研究生科研创新计划(SJZZ15_0025)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)09-0070-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.005