血小板源性生长因子B及受体α mRNA在复发性尖锐湿疣皮损中的表达与意义*

王 军，陈希颖，刘雯蓓，常小丽，何彩凤，季必华

(皖南医学院弋矶山医院皮肤性病科，安徽芜湖 241000)

论著·临床研究

血小板源性生长因子B及受体α mRNA在复发性尖锐湿疣皮损中的表达与意义*

王 军，陈希颖，刘雯蓓，常小丽，何彩凤，季必华

(皖南医学院弋矶山医院皮肤性病科，安徽芜湖 241000)

目的 研究血小板源性生长因子B(PDGF-B)及其受体α(PDGFR-α) mRNA在复发性尖锐湿疣皮损中的表达及意义。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应检测复发性、未复发性尖锐湿疣皮损和正常皮肤中PDGF-B及PDGFR-α mRNA表达水平。结果 尖锐湿疣复发组、未复发组的PDGF-B和PDGFR-α mRNA表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；复发组PDGF-B和PDGFR-α mRNA表达水平高于未复发组，复发组治疗前PDGF-B和PDGFR-α mRNA水平高于治疗后(P<0.01)。结论 PDGF-B和PDGFR-α mRNA可能与尖锐湿疣的复发有一定的关系。

尖锐湿疣；生长因子；血小板源性；受体；实时荧光定量聚合酶链反应

血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor-B，PDGF-B)及受体α(PDGFR-α)属于血小板源性生长因子及受体家族，二者结合后通过磷酸化促进细胞的生长和分裂[1-2]，刺激细胞增殖和血管增生以实现肿瘤组织的生长。尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是皮肤性病科的常见疾病，目前无特殊有效的治疗方法，临床上易复发，并有恶变的可能。本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应来检测PDGF-B、PDGFR-α mRNA在初发和复发CA皮损以及对照组织中的表达水平，并分析PDGF-B、PDGFR-α mRNA与复发性CA之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2012年3月至2014年4月本院门诊收治的46例CA患者作为试验组，均具有典型皮损，并经醋酸白实验证实，部分病例经皮肤病理确诊，取材时患者均未接受任何治疗(包括免疫调节剂和糖皮质激素)，其中男28例，女21例；年龄22～72岁，平均29岁；病程6～38 d，平均14.5 d。男性患者皮损位于包皮、龟头、冠状沟16例，肛周7例，其他5例；女性患者皮损位于外阴、阴道口19例，其他2例。随机选取20例泌尿外科手术切除包皮的健康成年男性作为对照组，年龄18～58岁，平均26.7岁，无其他疾病和服药史者。该研究获得医院伦理委员会通过和患者知情同意。对CA患者给予二氧化碳激光去除疣体，同时口服胸腺肽胶囊10 mg，每天3次，共服用28 d，临床观察3个月；随访观察期内如有新皮损出现，归为复发组，同时进行实时荧光定量聚合酶链反应检测PDGF-B及受体α的基因，未复发的归为未复发组。

1.2 仪器与试剂 PDGF-B、PDGFR-α浓缩型兔抗人多克隆抗体(福州迈新生物技术有限公司),RNA提取试剂盒购自Qiagen公司,Real Time qRT-PCR 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司,PDGF-B、PDGFR-α、β-actin引物均由上海赛百盛公司合成。PCR 扩增仪为Roche Light Cycler 480-Ⅱ，紫外分光光度计为日本岛津公司产品(UV-3200)。

1.3 方法

1.3.1 取材 按标准采集初发CA及复发CA皮损及健康人包皮组织标本，放入密封无菌保存管中，置于液氮罐中保存。

1.3.2 总RNA提取与定量 在液氮速冻条件下将标本组织磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，把组织粉末转移到1.5 mL eppendorf管中,使用RNeasy Mini Kit试剂盒，按照操作说明书提取总RNA。紫外分光光度计测定提取总RNA浓度,A260/A280比值为1.8～2.0,-80 ℃保存备用。

1.3.3 cDNA的合成 取 500 ng总RNA 在25 μL反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下:10×RT 缓冲液 5 μL,oligo dT(18) 1 μL,dNTP 3 μL,RNAse Inhibitor 1 μL,M-MLV逆转录酶1 μL,加入DEPC处理水至25 μL。70 ℃预变性 5 min,42 ℃孵育 60 min,-20 ℃保存备用。

1.3.4 PCR 反应 按试剂盒操作程序进行。反应体系为20 μL，包括cDNA 2 μL，SYBR green Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。目的基因PDGF-B:上游5′-CCC AGC AGC TCA AGA AGA AAA-3′，下游5′-CAA AGA GCG ACC CCA TCA GT-3′，扩增产物片段长度110 bp；目的基因PDGFR-α:上游5′-TGC TAT CGG CAG ATG ATG CT-3′，下游5′-GGC CAA TCT GGC TCA GTC TTC-3′，扩增产物片段长度140 bp；内参照基因β-actin:上游5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3′，下游5′-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3′，扩增产物片段长度245 bp。反应条件:预变性 95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40个循环。融解曲线分析为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.3.5 结果判定 采用Relative Quantification检测模式软件分析结果。

2 结 果

2.1 CA复发情况 46例CA患者，复发组有30例，复发率为65%，复发时间为11～75 d，平均(24.7±14.1)d，未复发组16例。

2.2 PDGF-B mRNA及PDGFR-α mRNA的表达 PDGF-B mRNA和PDGFR-α mRNA在CA复发组、未复发组、对照组的表达水平差异有统计学意义(P<0.01)，且两两组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。CA复发组和未复发组均明显高于对照组PDGF-B mRNA和PDGFR-α mRNA的表达水平，见表1。

表1 3组PDGF-B和PDGFR-α mRNA表达水平比较

2.3 CA复发组治疗前后PDGF-B mRNA、PDGFR-α mRNA的表达 治疗前PDGF-B mRNA和PDGFR-α mRNA水平均高于治疗后(t=7.30、6.07，P<0.01)，见表2。

表2 CA复发组治疗前后PDGF-B、PDGFR-αmRNA表达水平

3 讨 论

尖锐湿疣是一种由人类乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)引起的常见而顽固的性传播疾病，潜伏期一般为2周至8个月，平均为3个月，且CA复发率高达50%以上[3]。目前研究表明CA的复发可能和患者的细胞免疫状态、亚临床感染、治疗不彻底、CA患者不良的生活状态以及合并其他性病等因素有关[4]。

血小板源性生长因子(PDGF)属于血管内皮生长因子家族，由 A、B、C、D 4条多肽链通过二硫键连接而形成同型或异型二聚体，组成血小板源性生长因子家族(PDGFs)。其中PDGF-B链编码基因位于第22号染色体，现已有研究发现该基因与原癌基因C-sis具有很同源性，其纯合二聚体PDGF-BB具有很强的促有丝分裂的作用。PDGFR-α是PDGF靶细胞上的特异性受体，与PDGF结合后可使其发生二聚化，激发酪氨酸激酶的活性，从而使PDGFR发生自磷酸化[5]，继而激活下游的细胞内分子，改变细胞RNA含量，促进细胞的生长和分裂[1-2]，表现为血管增生和细胞增殖。部分研究还表明二者结合后以PDGF-B/PDGFR-α的形式形成自分泌刺激环的方式[6]，通过一系列级联的方式，实现强的有丝分裂原的作用，而刺激细胞增殖和血管增生以实现肿瘤组织的生长[7]。 目前已经有PDGF及受体的抑制剂生产出来，如伊马替尼、尼罗替尼、巴菲替尼等，这些药物属于PDGFR酪氨酸激酶抑制剂，对PDGFR具有选择性，能抑制血管的生成，已经被批准用于治疗胃肠道肿瘤和血液系统肿瘤[8-10]，并取得一定的效果。

本课题组前期研究使用免疫组化的方法，定性地对总的PDGF及其受体α、β与CA的关系进行了阐述，表明在CA组织中PDGF及受体的阳性表达程度明显增强[11]。本研究对CA复发组、未复发组和对照组皮损中PDGF-B及其受体α mRNA水平进行检测,发现PDGF-B及其受体α mRNA在复发组中的表达明显高于未复发组和对照组，推测PDGF-B及受体α与CA的复发有一定的关联；PDGF-B及其受体α mRNA在初发CA皮损中的表达明显高于对照组，提示PDGF-B及其受体α可能参与了CA皮损的发生和发展，这和笔者前期的研究一致；在CA患者的随访期结束后，在CA复发组中对治疗前后皮损PDGF-B及受体α基因的mRNA表达水平进行统计分析，二者之间差异有统计学意义，这是否与患者使用胸腺肽口服治疗有关，尚不能确定，需要扩大样本进行进一步研究。

[1]Hou X,Kumar A,Lee C,et al.PDGF-CC blockade inhibits pathological angiogenesis by acting on multiple cellular and molecular targets[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(27):12216-12221.

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[5]Ostendorf T,Eitner F,Floege J.The PDGF family in renal fibrosis[J].Pediatr Nephrol,2012,27(7):1041-1050.

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[11]王军，崔勇，杨森，等．血小板源性生长因子及受体在尖锐湿疣皮损中的表达和意义[J]．中国皮肤性病学杂志，2009，23(3)：142-144．

Expression and significance of platelet derived growth factor B and its receptors α in skin lesions of recurrent condyloma acuminatum*

Wang Jun,Chen Xiyin,Liu Wenbei,Chang Xiaoli,He Caifeng,Ji Bihua

(Department of Dermatology,Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu,Anhui 241000,China)

[Abstract] Objective To investigate the expression of platelet-derived growth factor B(PDGF-B) and PDGFR-α mRNA in the skin lesion of recurrent condyloma acuminatum(CA) and to explore its relationship with recurrent condyloma acuminatum.Methods The expressions of PDGF-B and PDGFR-α mRNA in the lesions of recurrent CA and Nonrecurrent CA were investigated by Real-Time-PCR,and the normal foreskins were taken as controls.Results The PDGF-B and PDGFR-α mRNA levels in the recurrent CA group and non-recurrent CA group were significantly higher than those in the normal control group,the differences were statistically significant(P<0.05).The expressions of PDGF-B and PDGFR-α mRNA in the recurrent CA group were higher than those in the non-recurrent CA group(P<0.01).Furthermore,the expressions of PDGF-B and PDGFR-α mRNA before treatment in the recurrent CA group were higher than those after treatment(P<0.01).Conclusion PDGF-B and PDGFR-α mRNA might haue a certain relation with CA recurrence.

condyloma acuminatum;growth factor,platelet-derived;receptor;real-time-PCR

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.015

2013年度高校省级自然科学研究项目(KJ2013B324)。 作者简介:王军(1978-)，硕士，副主任医师/副教授，主要从事性传播疾病方面的研究。

R752.5+3

A

1671-8348(2017)13-1773-02

2016-12-01

2017-01-19)