转移相关基因2对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响

马鹏，冯俊，杜经纬

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充 637000)

转移相关基因2对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响

马鹏，冯俊，杜经纬

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充 637000)

目的：探讨转移相关基因2(MTA2)对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响。方法：通过针对MTA2基因的小干扰RNA(siRNA-MTA2)对MTA2基因表达进行下调，采用RT-PCR和Transwell检测转染，作为实验组，对照组转染阴性对照(sicontrol)，通过MTT、细胞划痕实验和Transwell法分别检测MTA2对Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响。结果：实验组MTA2mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)，实验组培养7d和9d时细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.05)，实验组细胞迁移能力和细胞侵袭能力明显低于对照组(P<0.05)。结论：MTA2与喉癌细胞系Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭密切相关，有望成为治疗喉癌的靶点。

MTA2；喉癌细胞；Hep-2；增殖；迁移

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，近年来其发病率呈逐年增加的趋势，严重威胁着患者的身体健康[1]。研究证实，抑癌基因功能缺失性突变以及喉癌原癌基因的异常表达会引发肿瘤细胞过度增殖[2]。MTA2是一种促癌基因，能够调节细胞骨架的构建和肿瘤细胞的凋亡[3]，而关于MTA2对喉癌细胞系Hep-2生物学行为的影响目前比较少。为了探讨MTA2对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响，本文作出如下研究。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

Transwell小室、MTA2抗体、DMEM、Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG试剂盒(美国英杰生命技术有限公司)；siRNA-MTA2、体外转录合成的siRNA与阴性对照(上海吉玛制药技术有限公司)；逆转录酶、RNA酶抑制剂(美国Promega公司)；ABI 7500 Sequence Detector仪器(美国ABI公司)；喉癌细胞系Hep-2(中国科学院上海细胞生物学研究所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hep-2细胞在含有10%的胎牛血清(FBS)的培养液中，在饱和湿度环境为37 ℃、5%CO2的条件下培养，当细胞处于对数生长期时取出。

1.2.2 RT-PCR检测 快速提取(TRIZOL法)细胞总RNA，取2 μg，在37 ℃下通过逆转录酶和RNA酶抑制剂反转录合成cDNA，用TaqMan探针、cDNA 40 ng、Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 10 μL、浓度为10 μmol/L的正义反义引物0.4 μL。反应条件及操作步骤如下：50 ℃下温育处理2 min，95 ℃下预变性处理3 min，95 ℃下变性处理半分钟，58 ℃下退火延伸1 min，将上述操作循环往复40次。各基因分别检测三次，将荧光信号到达阀值时的循环次数作为CT值，△T值为目的基因CT值减去管家基因CT值，以2-△CT表示mRNA的相对表达量。

1.2.3 蛋白质印迹检测 制备聚丙烯酰胺垂直平板凝胶(4%浓缩胶和10%分离胶)，40 μg总蛋白通过80V电压电泳3 h后，再70 V电压电泳3 h，转印至PVDF膜。在室温下，用TBS-T溶液封闭1 h，然后加入鼠抗人MTA2一抗，内参抗体选择β-actin，于4 ℃下轻摇过夜，用TBS-T洗6遍，添加以HRP标记过的二抗，在室温下孵育1 h，然后再用TBS-T洗6遍，用蛋白质免疫印迹检测试剂显色1～2 min，X线光片曝光显影，观察细胞核组织中MTA2蛋白表达。

1.2.4 siRNA转染 实验组转染小干扰RNA(siRNA-MTA2)，对照组转染阴性对照(sicontrol)，将2×105个Hep-2细胞接种于6孔板，常规培养一段时间。用100 nmol/L小干扰RNA(siRNA-MTA2)和阴性对照分别与2 μL Lipofectamine 2000转染试剂在50 μL培养基中溶解，经过5 min孵育后再充分混合20 min，置入500 μL OPTI-DMEM无血清培养基细胞中，培养6 h后，再用含血清的RPMI-1640培养基进行培养。转染48 h后即可进行蛋白表达、基因表达检测等实验。

1.2.5 MTT检测 将Hep-2分别用Lipofectamine 2000、阴性对照和siRNA-MTA2进行转染，48 h后用胰酶对对数期生长细胞进行消化处理，然后予以离心处理，得到细胞悬浮液，然后将细胞计数浓度设为1 000～10 000/孔，孵育处理(37 ℃、5% CO2)，待孔底铺满细胞后，每个样品做三个复孔，分别于24/48/72 h加入10 mL 5 g/L的MTT溶液，培养4 h后，用PBS冲洗2～3遍，每个孔中添加二甲基亚砜(DMSO)100 μL，缓慢振荡10 min，通过酶联免疫法测量各孔在490 nm处的吸光度(A值)。

1.2.6 Transwell检测 将在500 μL无血清培养基的5×104个siRNA-MTA2和阴性对照细胞分别在含Metrigel和不含Metrigel得Transwell上室，在下层加入75 μL含有10%的FBS细胞培养液进行培养，8 h后将Transwell小室取出，用棉签轻轻擦去上层未穿孔的细胞，然后用苏木素做染色处理并封片，于镜下观察穿孔细胞数量。

1.3 统计学分析

所有数据均经EXCEL录入计算机，使用SPSS 19.0处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05说明组间差异具统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率鉴定

实验组mRNA表达水平及蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见图1和图2。

2.2 MTA2对Hep-2细胞增殖的影响

实验组培养7 d和9 d时细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组吸光度比较

*P<0.05，与对照组比较。

2.3 MTA2对Hep-2细胞迁移的影响

实验组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.05)，见图3。

2.4 MTA2对Hep-2细胞侵袭的影响

实验组细胞侵袭能力明显低于对照组(P<0.05)，见图4。

3 讨论

喉癌在临床上比较常见，是头颈部恶性程度较高的肿瘤之一，目前临床上通过化疗、放疗和手术治疗均不能起到明显的疗效，预后较差，对患者的生活质量无显著改善[4]。随着研究的深入，喉癌治疗得到一定程度的突破，肿瘤分子生物学技术在喉癌治疗中得到应用，而且喉癌发病机制也得到深入研究，分子靶向治疗和抑癌基因成为治疗喉癌的重要手段。

MTA2是一种新型的促癌基因，蛋白分子量为70KDa，编码为668个氨基酸，基因定位在11q1213[5]。研究证实，MTA2会参与到核小体的组成中，在多种肿瘤细胞系中表达且与肿瘤侵袭转移密切相关[6-7]。本研究结果显示，实验组MTA2mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)，实验组培养7 d和9 d时细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.05)，实验组细胞迁移能力和细胞侵袭能力明显低于对照组(P<0.05)，这可能是由于MTA2对细胞粘附进行调节，对细胞外基质进行降解最终实现。

MTA2可作为检测细胞转移的重要指标，是一个潜在的分子标志物，但是其分子机制尚不明确[8-9]。有研究指出，MTA2对SETD6启动子活性具有转录调节功能，可加快乳腺癌细胞的扩散、增殖及侵袭[10-12]。本研究结果提示，MTA2对喉癌细胞的扩散、增殖、侵袭等具有显著抑制效果，可据此推测，MTA2有很大可能参与了肿瘤细胞的转移过程[13]。

综上所述，MTA2与喉癌细胞系Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭密切相关，能够起到促癌基因的作用，有可能用于喉癌的临床诊断与治疗。

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[4] 隋颖，康健，王晓光.丹皮酚诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的体外研究[J].实用肿瘤学杂志，2013，27(4)：344-349.

[5] 于锋,黄鑫,艾毛毛,等.siRNA干扰β-catenin基因表达后喉癌Hep-2细胞对顺铂化疗敏感性的研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,29(13):1143-1147.

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[9] Cao P,Zhou L,Zhang J,etal.Comprehensive expression profiling of microRNAs in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Head Neck,2012,10(5):190-195.

[10]陈磊，郑树艳，黄永望.MTA2对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响[J].中国实验诊断学，2015，19(6)：883-885.

[11]谢杰斌,庞月珊,王崇树,等.自噬抑制剂3-MA对结直肠癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖的影响[J].川北医学院学报,2015,30(1):60-63.

[12]罗大虎,娄卫华.MCPH1基因对喉癌Hep-2细胞迁徙及侵袭影响[J].医药论坛杂志,2016,37(10):27-29.

[13]许里,徐新宇,林振中.CRYAB在喉癌中的表达变化及临床意义[J].南京医科大学学报(自然科学版),2016,36(9):1095-1100.

(学术编辑：刘海)

Effect of metastasis associated gene 2 on proliferation,migration and invasion of laryngeal carcinoma cell line Hep-2

MA Peng，FENG Jun，DU Jing-wei

(DepartmentofOtorhinolaryngology-HeadandNeckSurgery，NanchongCentralHospital，SecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To investigate the effect of metastasis associated gene 2 (MTA2) on the proliferation,migration and invasion of laryngeal carcinoma cell line Hep-2.Methods：MTA2 gene expression was down regulated by small interfering RNA (siRNA-MTA2) of MTA2 gene,and the transfection was detected by RT-PCR and Transwell.As the experimental group,the control group was transfected with negative control (sicontrol),and the effect of MTA2 on the proliferation,migration and invasion of Hep-2 was detected by MTT,cell scratch test and Transwell assay.Results:the expression level of MTA2mRNA and protein in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P<0.05).The cell proliferation ability of the experimental group was significantly lower than that of the control group (P<0.05) when cultured in 7d and 9D,The cell migration ability and invasion ability of the experimental group were significantly lower than those of the control group (P<0.05).Conclusion: MTA2 is closely related to the proliferation,migration and invasion of Hep-2 cell line,which is expected to be a target for the treatment of laryngeal cancer.

MTA2;Laryngeal cancer cell;Hep-2;Proliferation;Migration

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.02.005

四川省教育厅项目(13ZB0241)；川北医学院博士科研启动项目(CBY-QD-08)

2016-10-10

马鹏(1981-)，男，硕士，主治医师。

冯俊，E-mail：flj20041201@163.com

时间：2017-5-5 16∶46

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170505.1646.010.html

1005-3697(2017)02-0172-03

R739.65

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