miR—10b对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

王勇强　吴林波　陈帆

[摘要] 目的 探讨miR-10b在人肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 搜集兰州军区乌鲁木齐总医院46例肝癌组织作为观察组，同期选取18例正常肝组织作为对照组，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法检测受试者miR-10b的表达水平，分析miR-10b表达与肝癌组织病理特征之间的关系；利用脂质体2000向肝癌细胞系HepG2转染人工化学合成miR-10b模拟物（miR-10b mimics）、miR-10b抑制剂（miR-10b inhibitor），同时设置阴性对照组（NC+脂质体2000），采用MTT实验检测HepG2肝癌细胞增殖能力，采用Transwell实验及细胞划痕实验检测HepG2肝癌细胞侵袭、迁移能力。 结果 肝癌组miR-10b水平较对照组明显上调表达（P < 0.05），且肝癌转移组miR-10b水平明显高于未转移组（P < 0.05）；miR-10b高表达组与低表达组患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无肝硬化以及肿瘤数量之间比较差异无统计学意义（P > 0.05），肝癌患者miR-10b表达与肝癌是否转移以及肝癌的美国癌症联合委员会（AJCC）分期有关，且肝癌转移患者miR-10b表达高于未转移患者（P < 0.05），Ⅲ～Ⅳ期患者miR-10b表达高于Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05）；miR-10b过表达组HepG2细胞增殖能力明显高于miR-10b抑制组，过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞生长趋势接近一致；miR-10b过表达组HepG2细胞侵袭、迁移能力较过表达阴性对照组均明显增强，miR-10b抑制组HepG2细胞侵袭、迁移能力较抑制表达阴性对照组明显减弱，过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞侵袭、迁移能力基本一致。 结论 miR-10b在人肝癌组织中的表達水平明显高于正常肝组织，抑制miR-10b表达可有效降低肝癌细胞的增殖、侵袭及转移能力。

[关键词] miR-10b；肝癌；增殖；侵袭；转移

[中图分类号] R735.705 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（a）-0025-06

Effects of miR-10b on the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

WANG Yongqiang WU Linbo CHEN Fan▲

Department of Oncology， Urumqi General Hospital， Lanzhou Military Area Command， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830099， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-10b in human hepatocellular carcinoma and its effect on the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells. Methods Forty-six cases of hepatocellular carcinoma in Urumqi General Hospital， Lanzhou Military Area Command were collected as the observation group， and 18 cases of normal liver tissues were selected as the control group. The expression levels of miR-10b of the subjects were detected by quantitative Real-time PCR （qRT-PCR） method， the relationship between the expression of miR-10b and pathological features of tissue of hepatocellular carcinoma was analyzed； the artificial chemical synthesis miR - 10b mimics， miR-10b inhibitor were transfected into hepatocellular cell line HepG2 by lipofectamine 2000， and the negative control group （NC + lipofectamine 2000） was set. MTT assay was used to detect the proliferation capacity of HepG2 cells， and Transwell assay and cell scratch test were used to detect the invasion， migration capacity of HepG2 cells. Results The level of miR-10b in liver cancer group was significantly higher than that of control group （P < 0.05）， and the level of miR-10b in metastatic hepatocelluar carcinoma group was significantly higher than that of non-metastasis group （P < 0.05）； the differences of gender， age， tumor differentiation， liver cirrhosis or not， and cancer number between high expression of miR-10b group and low expression of miR-10b group were not statistically significant （P > 0.05）； the expression of miR-10b in patients with liver cancer was related to the transfer or not of liver cancer and the American Joint Committee on Cancer （AJCC） stage of liver cancer， and the expression of miR-10b in patients with metastatic hepatocelluar carcinoma was higher than that of non-metastasis patients （P < 0.05）， the expression of miR-10b in patients with Ⅲ-Ⅳ stage was higher than that of patients with Ⅰ-Ⅱ stage （P < 0.05）； the proliferation capability in excessive expression of miR-10b group was higher than that in miR-10b inhibition group， the growth tendency of HepG2 cells of excessive expression negative control group and suppression expression negative control group was almost the same； the invasion， migration capacity of HepG2 cells in excessive expression of miR-10b group was stronger than that of excessive expression negative control group， the invasion， migration capacity of HepG2 cells in miR-10b inhibition group was weaker than that of suppression expression negative control group， the invasion， migration capacity of excessive expression negative control group and suppression expression negative control group was almost the same. Conclusion The expression level of miR-10b in tissue of human hepatocellular carcinoma is significantly higher than that of normal hepatic tissue. The inhibition expression of miR-10b can effectively reduce the proliferation， invasion and migration capacity of hepatocellular carcinoma cells.

[Key words] miR-10b； Hepatocellular carcinoma； Proliferation； Invasion； Migration

原发性肝癌（HCC）是全球范围内最为常见的恶性肿瘤之一[1]，其发病率及病死率在世界范围内均呈现明显上升趋势[2]。HCC早期发病无明显症状，大多数患者确诊时已为癌症进展期，其发病机制复杂，目前临床上仍缺乏有效的治疗性药物。肝癌细胞的侵袭转移是导致肝癌患者死亡的主要原因，探究肝癌细胞的侵袭转移机制对于临床治疗肝癌具有重要意义。近年来，微小RNA研究为肿瘤靶向研究提供了新的研究方向，成为近年来肿瘤研究的新热点。相关研究表明[3-4]，微小RNA成员miR-10b在多种肿瘤中呈现高表达，且对肿瘤细胞的侵袭及转移具有促进作用。本研究旨在探讨miR-10b在人肝癌组织中的表达水平及其对肝癌细胞侵袭和转移的影响，试图为临床诊断及治疗肝癌提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本 搜集2015年2月～2016年2月兰州军区乌鲁木齐总医院（以下简称“我院”）46例肝癌患者所切除的肝癌组织作为观察组，所有患者肝癌组织切除前均未接受放化疗或者其他生物治疗。肝癌发生转移24例，其中肝内转移6例，肝门淋巴结转移5例，门静脉癌栓4例，血管侵犯5例，网膜侵犯3例，膈肌侵犯1例；未转移22例。选取同期18例正常肝组织作为对照组，其中肝破裂15例，肝脏血管瘤7例，对照组肝组织均经病理证实为无肝硬化及肝炎组织。所有标本均采用液氮速冻，并于-80℃保存。本研究经我院伦理委员会批准，且临床标本采集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.1.2 细胞系 人肝癌细胞系HepG2（来自于我院肝胆外科实验室）。

1.1.3 主要试剂与仪器 Trizol、DEPC、反转录试剂盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa公司，日本）；紫外分光光度计（Beckman公司，美國）；RT-PCR仪（ABI7700，美国ABI公司）；脂质体2000（Invitrogen公司，美国）；miR-10b mimics、miR-10b inhibitor、阴性对照NC（吉玛公司，上海）；Matrigel（BD公司，美国）；Transwell小室（Corning公司，美国）；MTT试剂盒（Sigma公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 Real-Time RT-PCR Trizol法分别提取肝脏组织总RNA，所提RNA经OD测定，OD260/OD280比值均在1.8～2.0，代表所提RNA为高纯度的RNA，没有蛋白质和DNA残留。28 s和18 s两条条带亮度比值基本符合比值2∶1，说明RNA完整性好，无降解（图1）。按照反转录试剂盒进行反转录。Real-Time RT-PCR所用引物由生物工程（上海）有限公司合成，序列如表1所示。Real-Time RT-PCR反应选用SYBR Prime Script RT-PCR Kit miRNA定量扩增体系进行，利用实时荧光定量PCR仪进行反应扩增。反应总体积10 μL：cDNA 1 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，引物0.4 μL，RNase H2O up to 10 μL。实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性15 min，95℃ 15 s，55℃ 20 s，70℃ 30 s进行30个循环。以RNA U6为内参，每个样品均设置3个复孔，结果采用2-ΔΔCT方法处理，其中ΔΔCT=（CTmiRNA-10b-CTU6）观察组-（CTmiRNA-10b-CTU6）对照组。

1.2.2 细胞转染 将HepG2细胞分为4组，分别标记为miR-10b抑制组、抑制表达阴性对照组、miR-10b过表达组、过表达阴性对照组。HepG2细胞消化并计数，取3×105个肝癌细胞接种于制备好的平板上，过夜培养，镜下观察细胞密度达40%时即可进行转染。利用脂质体2000向miR-10b抑制组转染miR-10b inhibitor，向抑制表达阴性对照组转染anti-NC，向miR-10b过表达组转染miR-10b mimics，向过表达阴性对照组转染miR-NC。所有操作严格按照试剂操作说明书进行。

1.2.3 MTT实验 采用MTT实验检测转染后HepG2肝癌细胞增殖能力，具体操作严格按照试剂盒说明书进行，分别转染24、48、72、96 h，采用酶联免疫分析仪，于波长490 nm处测定各个孔样本吸光度，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.2.4 Transwell实验 转染HepG2细胞培养48 h后消化并计数，取1×105个细胞置于已灭菌1.5 mL EP管中，滴加200 μL空白培养基重悬细胞，按照Transwell小室试剂盒说明严格操作（侵袭实验Transwell小室需铺Matrigel胶，迁移实验则不需要），常规培养24 h后取出小室，95%酒精固定，经结晶紫溶液染色后，200×显微镜下，每个样本随机选取5个视野计数。

1.2.5 细胞划痕实验 转染后HepG2细胞接种于6孔板，培养24 h，细胞密度达75%～80%时，用灭菌过的黄色枪头垂直划线，PBS洗去划下细胞，加入空白培养基，分别培养0、24、48、72 h进行拍照。

1.3 统计学方法

利用统计学软件SPSS 19.0进行研究数据统计学分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组与对照组中miR-10b表达水平比较

利用Real-Time RT-PCR方法，在内参基因RNA U6 Ct值差异无统计学意义的情况下，采用2-ΔΔCT方法计算miR-10b相对表达量，以对照组中一个miR-10b表达水平设置为1，肝癌组miR-10b水平较对照组明显上调表达（P < 0.05），且肝癌转移组miR-10b水平较肝癌未转移组明显上调表达（P < 0.05）。见图2。

2.2 miR-10b表达与肝癌病理特征关系

根据肝癌患者miR-10b表达水平中位数，将46例肝癌患者分为miR-10b高表达组与低表达组。结果表明，两组患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无肝硬化以及肿瘤数量之间比较差异无统计学意义（P > 0.05），肝癌患者miR-10b表达与肝癌是否转移以及肝癌的美国癌症联合委员会（AJCC）分期有关，且肝癌转移患者miR-10b表达高于未转移患者（P < 0.05），Ⅲ～Ⅳ期患者miR-10b表达高于Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05）。见表2。

2.3 转染HepG2细胞后miR-10b表达水平

Real-Time RT-PCR結果可见，miR-10b过表达组miR-10b水平明显高于过表达阴性对照组（P < 0.05），miR-10b抑制组miR-10b水平明显低于抑制表达阴性对照组（P < 0.05），过表达阴性对照组miR-10b水平与抑制表达阴性对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），转染成功，可用于后续研究（图3）。

2.4 miR-10b表达对肝癌细胞增殖能力影响

MTT增殖实验结果可见，miR-10b过表达组HepG2细胞增殖能力明显高于miR-10b抑制组，过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞生长趋势接近一致，HepG2细胞增殖能力介于miR-10b过表达组与miR-10b抑制组之间（图4）。

2.5 miR-10b表达对肝癌细胞侵袭及迁移能力影响

Transwell侵袭实验，肝癌细胞结晶紫染色后，200×显微镜下观察结果显示，miR-10b过表达组HepG2细胞侵袭能力较过表达阴性对照组明显增强（P < 0.05），miR-10b抑制组HepG2细胞侵袭能力较抑制表达阴性对照组明显减弱（P < 0.05），过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞侵袭能力基本一致（图5）。

Transwell迁移实验，肝癌细胞结晶紫染色后，200×显微镜下观察结果，miR-10b过表达组HepG2细胞迁移能力较过表达阴性对照组明显增强（P < 0.05），miR-10b抑制组HepG2细胞迁移能力较抑制表达阴性对照组明显减弱（P < 0.05），过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞迁移能力基本一致（图6）。

细胞划痕实验结果可见，miR-10b过表达组HepG2细胞迁移能力明显增强，细胞培养72 h后，miR-10b过表达组HepG2细胞划痕基本愈合，而过表达阴性对照组、miR-10b抑制组、抑制表达阴性对照组HepG2细胞划痕均未愈合，过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞愈合程度均高于miR-10b抑制组（图7）。

3 讨论

HCC是起源于肝脏上皮细胞或者间叶组织的肝脏恶性肿瘤[5]，早期患者无特异性症状，中晚期则出现肝区疼痛、乏力、腹胀、消瘦以及进行性肝肿大等症状[6-7]。目前关于HCC转移的分子机制尚未完全清楚[8]，临床上仍缺乏特异、敏感的HCC转移标志物，寻找与HCC迁移密切相关的新型生物学标志物，对于探究HCC侵袭及迁移机制以及为临床诊断、治疗HCC提供新靶点都具有重要意义。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类真核生物内源性非蛋白质编码的单链RNA，长度21～25个核苷酸[9-10]。miRNA仅占人类基因组序列1%～3%，却参与调控生物体30%以上基因编码，在生物体胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡等方面都扮演着重要角色。相关研究表明[11]，超过50%的miRNA位于染色体易发生缺失、突变和移位的脆性区域，而这些区域与癌症肿瘤的发生发展密切相关。目前，越来越多的miRNA被发现为抑癌或者促癌基因，参与肿瘤多条信号通路的传导，许多miRNA被证实参与人类乳腺癌[12]、胶质母细胞瘤、前列腺癌等肿瘤的侵袭与凋亡。因此，miRNA研究为肿瘤靶向诊断及治疗提供了新的研究方向，成为了目前肿瘤研究的新热点。miR-10b是位于2p31.1的miRNA家族成员[13]，该区域为调控生物体增殖分化的重要调控区域，与肿瘤的发生及发展有着密切联系，因此，miR-10b极有可能参与肿瘤进展[14-16]。已报道研究表明[17-18]，miR-10b在乳腺癌、食管癌等肿瘤发展中起促进肿瘤细胞转移及侵袭作用，但有关miR-10b在HCC中生物学功能研究较少，因此，本研究旨在探讨miR-10b在人肝癌组织中的表达水平及其对肝癌细胞侵袭和迁移的影响。

本研究结果表明，肝癌组miR-10b水平较对照组明显上调表达，且miR-10b表达与肝癌是否转移以及肝癌AJCC分期有关，肝癌转移患者miR-10b表达高于未转移患者，AJCC Ⅲ～Ⅳ期患者miR-10b表达高于AJCC Ⅰ～Ⅱ期，提示miR-10b表达与肝癌转移及进展有关；转染HepG2细胞后，miR-10b过表达组miR-10b水平明显高于过表达阴性对照组，miR-10b抑制组miR-10b水平明显低于抑制表达阴性对照组，过表达阴性对照组miR-10b水平与抑制表达阴性对照组比较无明显差异，说明miR-10b mimics转染后，HepG2细胞中miR-10b明显上调表达，而miR-10b inhibitor转染后，HepG2细胞中miR-10b明显下调表达，且anti-NC与miR-NC转染后，HepG2细胞中miR-10b表达水平相一致，提示转染成功，可进行下一步实验研究；MTT实验结果显示，miR-10b过表达组HepG2细胞增殖能力明显高于miR-10b抑制组，过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞生长趋势接近一致，HepG2细胞增殖能力介于miR-10b过表达组与miR-10b抑制组之间，提示miR-10b mimics明显促进HepG2细胞增殖，而miR-10b inhibitor可显著抑制HepG2细胞增殖；Transwell及细胞划痕实验结果显示，miR-10b过表达组HepG2细胞侵袭、迁移能力较过表达阴性对照组均明显增强，miR-10b抑制组HepG2细胞侵袭、迁移能力较抑制表达阴性对照组明显减弱，过表达阴性对照组与抑制表达阴性对照组HepG2细胞侵袭、迁移能力基本一致，说明miR-10b mimics转染后，HepG2细胞侵袭、迁移能力明显增强，而miR-10b inhibitor转染后，HepG2细胞侵袭、迁移能力明显减弱，提示miR-10b表达与HepG2细胞侵袭、迁移密切相关，miR-10b过表达可促进HepG2细胞的增殖、侵袭及迁移，反之，抑制miR-10b表达可抑制HepG2细胞的增殖、侵袭及迁移。

综上所述，本研究结果表明，miR-10b在人肝癌组织中的表达水平明显高于正常肝组织，抑制miR-10b表达可有效降低肝癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力，因此推测miR-10b可作为诊断HCC的一种新型肿瘤标志，具有很大的研究前景。

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（收稿日期：2016-08-06 本文编辑：张瑜杰）