结直肠癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表达的相关性及临床意义

赵 岩，孙 健，吴 影，王志强

结直肠癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表达的相关性及临床意义

赵 岩1，孙 健2，吴 影3，王志强1

目的 探讨Survivin、Caspase 9和Ki-67三种肿瘤相关因子在结直肠癌中表达的相关性。方法 采用免疫组化EliVision法检测50例结直肠癌、30例结直肠腺瘤和30例癌旁正常组织中Survivin、Caspase 9和Ki-67的表达，并分析三者与结直肠癌临床病理特征的关系。结果 Survivin和Ki-67在结直肠癌组织中的阳性率高于结直肠腺瘤和癌旁正常组织；而Caspase 9阳性率低于结直肠腺瘤和癌旁正常组织。Survivin与Caspase 9的表达呈负相关，与Ki-67表达呈正相关；Caspase 9与Ki-67的表达呈负相关。Survivin、Ki-67、Caspase 9的表达与结直肠癌分化程度、淋巴结转移及Dukes分期相关(P<0.05)。结论 Survivin可能通过抑制Caspase 9的激活，使细胞不能进行有效凋亡并异常增殖，从而促进结直肠癌的发生、发展。联合检测有助于了解结直肠肿瘤的生物学行为并对患者早期诊断、预后判断及干预治疗提供分子生物学支持。

结直肠肿瘤；Survivin；Caspase 9；Ki-67；免疫组织化学

结直肠癌是发生在结直肠黏膜上皮和腺体的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。随着动物高蛋白在人们饮食结构中的比重增加，我国结直肠癌患者数量逐年递增。现代医学研究证明，恶性肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞异常增殖、异常分化及细胞凋亡障碍密切相关，细胞凋亡机制异常是恶性肿瘤发生的重要原因之一，因此研究细胞凋亡与肿瘤的关系，已经成为肿瘤学研究的热点。Survivin、Caspase 9的表达均与结直肠癌的发生、发展有关，且两者在调控细胞凋亡方面存在关联。Ki-67是反映细胞增殖的重要生物学指标。本文采用免疫组化法检测Survivin、Caspase 9和Ki-67在结直肠癌组织中的表达并分析三者表达的相关性，希望从分子水平更深入了解结直肠癌的生物学发生机制，探讨它们与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分化程度和Dukes分期等临床病理因素的关系，为患者早期诊断、干预治疗和判断预后提供分子生物学支持。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2014年9月～2016年7月牡丹江医学院红旗医院病理科存档的结直肠癌手术切除标本50例，所有标本相关临床资料完整，患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗。其中男性32例，女性18例，年龄29～84岁，平均61.98岁，中位年龄61岁；高分化腺癌11例，中分化腺癌26例，低分化腺癌13例；根据Dukes分期：A+B期27例，C+D期23例；有淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者27例。取同时期30例结直肠腺瘤手术存档蜡块和30例癌旁>5 cm正常结直肠组织病理蜡块作为对照。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人Survivin多克隆抗体和鼠抗人Ki-67核抗原单克隆抗体均购自福州迈新公司。兔抗人Caspase 9多克隆抗体购自美国Abcam公司。DAB显色试剂盒和免疫组化EliVision Super/HRP检测试剂盒购自福州迈新公司。使用仪器有显微镜、切片机、烤箱、染色缸、孵育盒、高压锅。

1.3 方法 免疫组化染色采用EliVision法，取存档的组织蜡块，行HE和免疫组化染色。用已知的阳性切片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定 由两位高年资病理医师采用双盲法分别独立阅片。在光镜下观察阳性细胞呈棕褐色细颗粒状。Caspase 9定位于细胞核和细胞质，Ki-67定位于细胞核，Survivin定位表达于细胞核或细胞质。根据国内常用标准，即肿瘤细胞的阳性数及其染色反应的强度进行判定。染色强度：无阳性着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。采用高倍视野随机计数100个肿瘤细胞所占的比例，定位5级，未见阳性表达或阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相加：4～7分为阳性，0～3分为阴性。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件分别对计数资料进行χ2检验；两变量间关系采用Spearman相关性分析。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、Caspase 9和Ki-67在结直肠癌、结直肠腺瘤、正常结直肠组织中的表达(表1) Survivin蛋白定位于细胞质或细胞核(图1)。Survivin在结直肠癌中的阳性率明显高于结直肠腺瘤和正常结直肠组织，差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase 9主要定位于细胞质，胞核也有表达，呈棕黄色灶性或弥漫性分布(图2)。Caspase 9在结直肠癌中的阳性率低于结直肠腺瘤和正常结直肠组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。Ki-67定位于细胞核(图3)，Ki-67在结直肠癌中的阳性率高于结直肠腺瘤和正常结直肠组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 结直肠癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表达的相关性 结直肠癌中Survivin和Caspase 9的表达呈负相关(r=-0.362，P=0.010，表2)。Survivin和Ki-67的表达呈正相关(r=0.398，P=0.004，表3)。Caspase 9与Ki-67的表达呈负相关(r=-0.400，P=0.004，表4)。

2.3 Survivin、Caspase 9和Ki-67蛋白表达与结直肠癌临床病理因素的关系 Survivin、Caspase 9和Ki-67表达与结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小和浸润深度无相关性(P>0.05)。Survivin、Caspase 9和Ki-67表达与结直肠癌分化程度、淋巴结转移和Dukes分期具有相关性，差异有统计学意义(P<0.05，表5)。

表2 结直肠癌中Survivin和Caspase 9表达的相关性

r=-0.362,P=0.010

表3 结直肠癌中Survivin和Ki-67表达的相关性

r=0.398,P=0.004

表4 结直肠癌中Caspase 9和Ki-67表达的相关性

r=-0.400,P=0.004

表1 Survivin、Caspase 9、Ki-67在结直肠癌、结直肠腺瘤和癌旁正常结直肠组织中的表达

与结直肠腺瘤组相比，△P<0.05；与正常结直肠组相比，☆P<0.05；与结直肠癌组相比，*P<0.05

ABC

图1 Survivin在结直肠癌(A)、结直肠腺瘤(B)和癌旁正常组织(C)中的表达，EliVision法

图2 Caspase 9在结直肠癌(A)、结直肠腺瘤(B)和癌旁正常组织(C)中的表达，EliVision法 图3 Ki-67在结直肠癌(A)、结直肠腺瘤(B)和癌旁正常组织(C)中的表达，EliVision法

表5 Survivin、Caspase 9、Ki-67表达与结直肠癌临床病理特征的关系

*P<0.05

3 讨论

Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族的重要成员，是一个凋亡抑制剂。Survivin的表达广泛参与细胞凋亡、胚胎发育、血管生长，以及肿瘤免疫调节[1]。Survivin表达于各型胚胎组织，并在一些有高增殖活性的正常组织中表达，而在成熟的正常组织中几乎不表达[2]。研究表明，在很多恶性肿瘤中，如胃癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌[3-7]均发现Survivin高表达。Survivin可通过多种途径干扰多种因素诱导的细胞凋亡，其中就有干扰Caspase家族的诱导细胞凋亡通路。Caspase 9所在的Caspase家族通过蛋白酶级联反应控制细胞凋亡的发生与发展。在级联反应的上游Caspase 9等能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游Caspase，作为凋亡执行者诱发细胞凋亡[8]。本组实验结果显示，Survivin在结直肠癌中的表达明显高于结直肠腺瘤和癌旁正常组织(P<0.05)，这与张伟兴等[9]的结果一致。Survivin表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径及浸润深度无关(P>0.05)，与结直肠癌分化程度，淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)。本组实验中，Survivin在结直肠癌、腺瘤及正常组织中的表达是逐渐降低的，而在结直肠癌中，随着肿瘤恶性程度和病情进展的加深，Survivin的表达逐渐升高，这表明Survivin的表达一定程度反映了结直肠癌的发生进展情况，因此，Survivin在临床上具有潜在应用价值，可以作为一个分子标志物对结直肠癌进行诊断及判断预后。Caspase 9在癌旁正常组织中的表达明显高于结直肠腺瘤和结直肠癌中表达(P<0.05)，这与东星等[10]的研究结果一致。Caspase 9与结直肠癌分化程度、淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)。其在高分化肠癌中的表达明显强于中低分化的结直肠癌组织，随着Caspase 9的表达降低，细胞凋亡受到抑制，组织分化程度越低，提示Caspase 9在一定程度上参与肿瘤组织的分化。通过Spearman相关性分析得出Survivin与Caspase 9存在相关性，验证了Survivin可通过干扰Caspase 9的活化来实现抗细胞凋亡作用。Caspase 9亦可作为应用于临床的生物分子指标评估结直肠癌的发生、发展。Ki-67是细胞增殖的抗原标志物，其增殖指数越高，说明细胞增生越旺盛。在临床病理中，Ki-67常用来反映肿瘤的恶性程度，评估患者的预后及复发转移状况。Ki-67在本实验中与Survivin表达呈正相关，与Caspase 9表达呈负相关(P<0.05)，结合之前Survivin与Caspase 9呈负相关，表明Survivin高表达的结直肠癌组织其细胞凋亡受抑制，细胞过度增殖，恶性程度高，预后差；Caspase 9高表达的结直肠癌组织其细胞大量凋亡，增殖活力弱，预后良好。Ki-67可能与Survivin在肿瘤的发生、发展中表现为协同关系，而与Caspase 9为拮抗关系，这还需要更多实验进行验证与研究。本实验中Ki-67与肿瘤分化程度、淋巴结转移及Dukes分期有关(P<0.05)。表明Ki-67表达越强，癌细胞增殖活力越旺盛，肿瘤恶性程度越高，越易发生侵袭转移。Ki-67在评价肿瘤预后方面亦具有重要参考价值。

众所周知，几乎所有的癌症均会有一个癌前病变过程，但并非所有癌前病变均会发展成癌，这也是寻找可靠肿瘤标志物的意义所在。随着分子靶向治疗的发展，寻找肿瘤新的靶点也是科研工作者研究的方向。联合检测Survivin、Caspase 9和Ki-67可提高对结直肠癌诊断及判断预后的准确性，作为结直肠癌靶向治疗的靶点，也会为结直肠癌的综合治疗翻开崭新的篇章。

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黑龙江省研究生创新科研项目(2014YJSCX-20)、牡丹江医学院科学技术研究项目(ZSSD201620)

1牡丹江医学院红旗医院肿瘤科、3病理科，牡丹江 1570112牡丹江医学院机能学教研室，牡丹江 157011

赵 岩，男，硕士研究生。E-mail: 373433006@qq.com 王志强，男，硕士生导师，主任医师，通讯作者。E-mail: zqwang56@126.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.019.html

1001-7399(2017)04-0435-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.019

R 735.3

A

接受日期：2017-02-16