阿那曲唑与格列本脲对子宫内膜异位症细胞凋亡的影响①

孟庆哲，薛 宇，韩静嫒，张芮瑞，薛 琳，姜婷婷，赵雨晴

(1.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002;2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

阿那曲唑与格列本脲对子宫内膜异位症细胞凋亡的影响①

孟庆哲1，薛 宇1，韩静嫒1，张芮瑞2，薛 琳2，姜婷婷1，赵雨晴1

(1.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002;2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：阿那曲唑与格列本脲对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡的影响和作用。方法：采用人工诱导建立子宫内膜异位症大鼠模型，实验检测阿那曲唑与格列本脲治疗子宫内膜异位症大鼠前后病灶部位体积变化及雌性激素合成相关蛋白表达，子宫内膜异位症模型大鼠随机分为阿那曲唑组与格列本脲组，子宫内膜异位症大鼠子宫内膜细胞提取体外培养，阿那曲唑与格列本脲不同浓度处理体外培养细胞观察对增殖能力和细胞凋亡影响。运用ONN法检测细胞增殖能力和流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡情况。结果：阿那曲唑与格列本脲处理子宫内膜异位症大鼠后，病灶部位减小明显，抑制雌激素相关蛋白表达，影响体外培养细胞增殖能力与周期及凋亡。结论：阿那曲唑比格列本脲对雌激素相关蛋白表达影响大；格列本脲比阿那曲唑对细胞周期影响大。

阿那曲唑;格列本脲;子宫内膜异位症;细胞凋亡; 影响

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是有活性内膜细胞种植在子宫内膜以外位置形成常见妇科疾病。子宫内膜异位症治疗因病情轻重，患者年龄和生育情况有所不同[1]。常用治疗方法有：1.药物治疗：①假孕疗法。②假绝经疗法。2. 手术疗法：①半保守手术。②根治性手术。③腹腔镜手术和GnRHa药物结合。子宫内膜异位症是一种依赖雌性激素疾病，由于子宫内膜异位症患者需要长期服用激素，对患者心理与生理造成较大影响，子宫内膜异位症近年来患病率呈上升趋势[2]。子宫内膜异位症主要采用保守药物治疗，激素药物降低患者雌性激素水平来进行治疗。以往临床传统治疗具有显著疗效是降低雌性激素水平，临床上有出现严重不良反应病例，所以长期控制和治疗建议不采用激素药物方法[3]。子宫内膜异位症手术疗法临床观察术后复发率有 47.65%。子宫内膜异位症临床治疗中迫切寻找不良反应少与复发率低且疗效满意治疗手段。

阿那曲唑(AnastrozoleTablets)(瑞婷、瑞宁得)是非甾体类芳香化酶抑制剂。阿那曲唑主要是降低血浆雌激素水平，具有抑制乳腺肿瘤生长作用。临床主要应用在绝经后妇女辅助乳腺癌晚期治疗[4]。

格列本脲主要应用非胰岛素依赖型糖尿病针对饮食控制疗效不满意患者，患者β胰岛细胞能分泌一定胰岛素没有严重并发症，患者应用格列本脲可以降低空腹和餐后血糖。为了探索阿那曲唑和格列本脲对子宫内膜异位症药理学作用机理，本研究应用EMS大鼠进行细胞体外培养实验，探索研究阿那曲唑和格列本脲治疗子宫内膜异位症的药理学作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

主要试剂：阿那曲唑片(瑞婷)(规格：1mg，重庆华邦制药有限公司，国药准字H20020194)；格列本脲片(规格：2.5mg，山西云鹏制药有限公司，国药准字H14020780)。主要仪器：LSRFortessa流式细胞分析仪 ( 美国BDBiosciences)；PWT型电热恒温培养箱 (合肥华德利科学器材有限公司)；CTK120自动脱帽离心机 (湘仪离心机仪器有限公司)；RT-6000自动酶标仪(美国雷杜Rayto)[5]。

1.2 实验动物模型制备及诊断 1.2.1 实验动物

SPF级性成熟雌性未受孕大鼠 40 只，体质量(200±20)g，佳木斯大学实验动物中心提供。22～24℃、相对湿度50%～60%，饲养于佳木斯大学实验动物中心动物饲养室。

1.2.2 子宫内膜异位症大鼠动物模型制备与诊断

①子宫内膜异位症大鼠动物模型制备:SPF级性成熟雌性未受孕大鼠40只，每日阴道涂片定时检查，进行大鼠动情期规律统计，选择有规则动情周期，且连续正常两个动情周期大鼠，在第3个动情期参照文献[6]方法人工诱导EMS大鼠模型，建模过程进行剖腹与移植及缝合。

②子宫内膜异位症大鼠动物模型诊断标准:人工建立大鼠模型后第4周在动情期第2次剖腹。EMS诊断标准：参照文献[7]诊断标准：人工建模子宫内膜移植部分明显增大体积，呈结节状或囊状透明或半透明其内部有液体，表面有增生结缔组织并且有血管分布。

1.3 子宫内膜异位症大鼠分组及给药

子宫内膜异位症动物模型大鼠40只，随机分为格列本脲(1mg·kg-1) 组和阿那曲唑(1mg·kg-1)组，每组20只，均灌服阿那曲唑、格列本脲药物，灌服3 周后颈动脉穿刺大鼠全部处死。阿那曲唑、格列本脲药物治疗前后，检测阿那曲唑组和格列本脲组病灶体积、体外培养细胞增殖和凋亡等情况。

1.4 子宫内膜异位症大鼠病灶组织细胞分离及药物处理

①子宫内膜异位症大鼠病灶组织细胞分离体外培养:子宫内膜异位症大鼠病灶组织位置选取，病灶组织提取细胞体外培养分离。选取子宫内膜异位症大鼠病灶组织剪成若干小块，应用胰蛋白酶溶液消化30min然后加入胎牛血清终止。采用离心机离心细胞沉淀收集，细胞培养在10%胎牛血清DMEM培养基，培养基放在细胞培养箱37℃培养过夜，24h后换新培养基。

②子宫内膜异位症大鼠病灶组织体外培养细胞药物处理:阿那曲唑组和格列本脲组两组药物处理分离体外培养细胞，阿那曲唑组和格列本脲组细胞分别用0、10、100、1000μmol·L-1阿那曲唑或格列本脲处理72h。MTT法在处理过程中检测细胞活力。其中48h后细胞周期分布、凋亡、Bax(促凋亡蛋白)和Bcl-2(抑凋亡蛋白)表达用LSRFortessa流式细胞分析仪检测。

1.5 子宫内膜异位症大鼠病灶组织体外培养细胞周期检测

阿那曲唑组和格列本脲组药物处理72h后，收集阿那曲唑组和格列本脲组细胞。经过PBS洗涤用细胞周期检测试剂盒进行细胞染色，然后用LSRFortessa流式细胞分析仪进行细胞周期分布分析。

1.6 子宫内膜异位症大鼠病灶组织体外培养细胞凋亡检测

阿那曲唑组和格列本脲组药物处理72h后，收集两处理组细胞。细胞染色应用细胞凋亡检测试剂盒，细胞凋亡分析用LSRFortessa流式细胞分析仪。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行数据计量资料计算，采用t检验，P<0.05具有显著性差异。

2 结果

2.1 阿那曲唑和格列本脲治疗子宫内膜异位症大鼠前后病灶体积比较

子宫内膜异位症大鼠症状主要表现为异位病灶病理性增殖，病灶体积改变表现在治疗效果。经过阿那曲唑(1mg·kg-1)、格列本脲(1mg·kg-1)治疗3周后，子宫内膜异位症大鼠病灶体积比治疗前均有减小，治疗3周后与比治疗前对比差异显著(P<0.05)。阿那曲唑组对比格列本脲组差异不显著。见表1。

表1 阿那曲唑与格列本脲对EMS大鼠治疗 前后病灶平均体积

注：与治疗前比较，△P<0.05。

2.2 阿那曲唑和格列本脲治疗子宫内膜异位症大鼠体外培养细胞周期的影响

细胞周期分布运用LSRFortessa流式细胞分析仪分析，DNA合成前期细胞比例随格列本脲浓度升高而上升，DNA合成期细胞比例随格列本脲浓度升高而下降(P<0.05)。阿那曲唑对DNA合成前期细胞和DNA合成期细胞影响差异没有统计学意义。

表2 阿那曲唑与格列本脲对EMS大鼠体外 培养细胞周期影响

注：与DNA合成前期比较△P<0.05;同浓度组间比较☆P<0.05。2.3 阿那曲唑和格列本脲治疗子宫内膜异位症大鼠体外培养细胞凋亡的影响

细胞凋亡应用LSRFortessa流式细胞分析仪分析，体外培养细胞运用阿那曲唑和格列本脲处理，细胞凋亡比例呈现增加显著，随阿那曲唑和格列本脲处理浓度增加呈上升趋势(P<0.05)。Bax和Bcl-2表达检测结果显示：阿那曲唑和格列本脲处理体外培养细胞后，Bax表达水平升高、Bcl-2表达水平降低(P<0.05) 。说明阿那曲唑和格列本脲促进子宫内膜异位症大鼠体外培养细胞凋亡。见表3。

表3 阿那曲唑与格列本脲对EMS大鼠体外 培养细胞凋亡影响

注：蛋白表达免疫印迹法测定。与 0μmol·L-1比较△P<0.05。

3 讨论

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是妇产科临床上常见病和多发病，子宫内膜异位症发病率近年来有逐渐升高趋势。目前尚未完全明确子宫内膜异位症发病机制。世界卫生组织目前普遍认为子宫内膜异位症发病可能与多种因素有关：①种植学说：月经血或脱落子宫内膜碎片经过输卵管流入腹腔，种植盆腔脏器表层产生EMs病灶；②化生内膜：人体浆膜上皮在性腺激素、炎症、机械因素刺激下转化形成EMs病灶；③良性转移：罕见的发病原因，主要通过血液循环或淋巴系统把子宫内膜碎屑转移停留在肺部、脑膜、心包、四肢及其他远端的EMs病灶。④医源性的内膜移植：剖宫产、刮宫、会阴侧切和人工流产术等人为造成使子宫内膜移植到某些部位形成EMs病灶；⑤免疫防御功能缺陷：随月经血逆流至腹腔子宫内膜激活体内免疫系统，大量免疫细胞及体液围歼进行消除，如果此时体内免疫功能缺陷会产生EMs病灶；⑥体质及遗传因素：肥胖、超重等体质因素及家族遗传等与EMs发生有密切关系[8]。

目前，对于子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)发病原因不明确，研究探讨宫内膜异位症病因和机制成为妇科热点。对于治疗子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)过程减少不良反应降低治疗后复发率，也是子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)治疗研究中重要内容[9]。

本研究以人工诱导大鼠子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)为实验模型，经过阿那曲唑和格列本脲治疗，子宫内膜异位症大鼠病灶体积变小。阿那曲唑和格列本脲对子宫内膜异位症有疗效，阿那曲唑和格列本脲药物浓度对EMS大鼠内膜体外培养细胞增殖能力抑制及凋亡作用呈正比。阿那曲唑有效抑制雌性激素合成雌性激素含量减少。格列本脲对雌性激素合成无影响，子宫内膜异位症大鼠内膜体外培养细胞DNA合成期细胞比例和周期格列本脲可抑制。子宫内膜异位症大鼠内膜体外培养细胞中凋亡促进蛋白格列本脲可使其增加，导致抑制凋亡蛋白减少。子宫内膜异位症大鼠内膜体外培养细胞两方面(增殖能力、凋亡作用)及抑制雌性激素合成阿那曲唑和格列本脲均有效。阿那曲唑可有效抑制雌性激素合成，格列本脲对子宫内膜异位症大鼠内膜体外培养细胞周期DNA合成期有效[10]。

本研究表明格列本脲和阿那曲唑对于治疗大鼠子宫内膜异位症(endometriosis，EMS) 有良好治疗效果，大鼠子宫内膜异位症(endometriosis，EMS) 细胞体外培养过程抑制作用均有效。阿那曲唑和格列本脲有望解决治疗子宫内膜异位症(endometriosis，EMS) 过程中易发不良反应，并为长期预防子宫内膜异位症(endometriosis，EMS) 复发提供更多临床解决方案。阿那曲唑和格列本脲在治疗 子宫内膜异位症(endometriosis，EMS) 临床应用尚需进一步探讨。

[1]张立娜，吕敬媛，宋宝杰，等.HtrA1丝氨酸蛋白酶在子宫内膜异位症中的表达[J].黑龙江医药科学，2016，39(2)：42-43

[2]胡玉红，徐建. 免疫学参数HLA与腹腔子宫内膜异位症病因学关系[J]. 黑龙江医药科学，2014，37(6)：74-75

[3]陈兵，梁立春，刘爽，等.VEGFR-3/CD31在子宫内膜异位症中的表达及临床意义[J].黑龙江医药科学，2014，37(4)：1-4

[4]宋继荣，朴英兰，李佳琳，等.青蒿琥酯对大鼠子宫内膜异位症模型血清VEGF和MMP-9的影响[J]. 黑龙江医药科学，2014，37(2)：59

[5]梁立春，杨静，冷淑杰，等.血管内皮生长因子与子宫内膜异位症发病关系的研究进展[J]. 黑龙江医药科学，2014，37(4)：32-33

[6]曾静雯.罗氏内异方对子宫内膜异位症大鼠模型妊娠的干预研究,[D] 广州中医药大学博士论文,2015

[7]少权，洪 婷，姜芳芳，等.来曲唑联用孕三烯酮与单用孕三烯酮治疗子宫内膜异位症的对比研究[J].中国临床药理学与治疗学，2013，12(11):198-199

[8]宋淑芳，尹利荣，齐之迎. 来曲唑治疗大鼠子宫内膜异位症模型作用及机制的研究[J]. 现代妇产科进展，2011，20(1)：35-38

[9]马华姝，樊宏英，韩晓瑞. 来曲唑联合二甲双胍治疗子宫内膜异位症的疗效观察[J]. 中华临床医师杂志(电子版)，2015，9(11)：2233-2235

[10]侍晓辰，周仕萍，闵美林，等，阿那曲唑替代他莫昔芬对绝经期后乳腺癌术后患者子宫内膜的影响[J].重庆医学，2011，40(6)：1631-1632

1.黑龙江省大学生创新创业训练计划，编号：201610222084；2.佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：xsyd2016-12；3.佳木斯大学科学技术重点项目，编号：12Z1201508；4.佳木斯大学附属第一医院院级培育课题，编号：2014；5.黑龙江省教育厅项目，编号：12511570。

孟庆哲(1996～)男，黑龙江佳木斯人，在读本科生。

薛宇(1988～)女，黑龙江佳木斯人，医师。E-mail:xueyu@163.com。

R

B

1008-0104(2017)02-0022-02

2017-01-04)