恐惧记忆的形成对大鼠内侧前额叶皮层局部场电位的影响

张丙淑 随 力 黄思佳

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

恐惧记忆的形成对大鼠内侧前额叶皮层局部场电位的影响

张丙淑 随 力*黄思佳

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

根据大鼠恐惧记忆形成前后不同时间段局部场电位的变化特征，研究恐惧记忆的形成对内侧前额叶皮层局部场电位的影响。选取健康成年雄性SD大鼠8只，利用脑立体定位仪将微丝电极植入到大鼠的内侧前额叶皮层；手术恢复后1周，在清醒状态下，通过穿梭恐惧记忆训练诱导出大鼠的恐惧记忆。借助Cerebus神经信号记录系统，记录大鼠在清醒状态下恐惧记忆形成前和恐惧记忆形成后6 h及1、2、3、4、5、6 d的内侧前额叶皮层的局部场电位信号，并采用Neuroexplorer软件分析局部场电位信号。以功率谱密度和功率百分比参数为指标，对恐惧记忆形成前后的总功率和不同时间状态下的各频段(δ:1～3 Hz，θ:4～7 Hz，α:8～13 Hz，β:14～30 Hz，γ:31～100 Hz)功率百分比进行方差分析。实验结果显示，恐惧记忆形成后6 h，θ波和β波的功率百分比较恐惧记忆形成前具有显著性差异(P=0.017，P=0.017)，θ波较恐惧记忆形成前功率百分比增加，β波较恐惧记忆形成前功率百分比降低；另外，恐惧记忆形成后第1、2 d，δ波的功率百分比较恐惧记忆形成前具有显著性差异(P=0.03，P=0.049)，γ波的功率百分比较恐惧记忆形成前具有显著性差异(P=0.013，P=0.019)。研究表明，恐惧记忆的形成对内侧前额叶皮层神经信息处理的模式产生显著性的影响。

内侧前额叶皮层；恐惧记忆；局部场电位；穿梭实验

引言

植入到大脑皮层内的微电极可以采集到微电极周围由树突活动产生的局部场电位神经电信号，它反映来自神经元网络局部神经核团的活动状态。局部场电位(local field potential，LFP)是多个神经元兴奋性或抑制性突触后电位在记录点的总和，是在慢尺度时间窗口中产生的慢电位[1]。局部场电位可以反映电极尖端局部区域神经元群体突触后电位的总和，是大脑内局部大量神经元树突电位和的综合反映[2]。大量研究结果表明，在特定行为下，神经元放电与LFP有着密切的关系。LFP与脑电(electroencephalogram，EEG)相似，信号较弱，是连续的[3]。相对于脑电信号，LFP在时间和空间分辨率上都高，且频域特性明显，因此，LFP对于研究大脑信息处理机制有着重要的价值[4]。与脑电相似，根据LFP在不同频段的生理特征，可分为以下几个频段：δ频段为1～3 Hz，θ频段为4～7 Hz，α频段为8～13 Hz，β频段为14～30 Hz，γ频段为31～100 Hz等[5]。在LFP中，并非一种节律波单独存在，而是不同节律波的同时存在。LFP的相关研究表明，LFP信号参与了不同类型的生理活动[2]。已有研究表明，θ和γ频段是与记忆相关的重要的频段，γ频段的同步振荡在工作记忆中起着重要的作用[6]。Hasselmo等发现，LFP的θ频段振荡与记忆相关[7]。Benchenane等发现，大鼠执行Y迷宫任务时，海马和内侧前额叶皮质峰之间LFP的θ分量相干在学习和记忆中起着重要的作用[8]。

人的各种高级心理活动(如思维、意识、运动的计划等)都与前额叶皮层的功能有关，该部位的功能损伤与精神分裂症、帕金森病等许多精神、神经以及心理疾病有关。研究证明，前额叶皮层与情绪有着密切的关系，并且参与了记忆的编码，对人类的思维、情感、认知有着十分重要的作用。人类在面临不适合生存的刺激时会产生紧张、焦虑的情绪反映，并可导致机体产生急剧的行为和精神内分泌等方面的改变，甚至导致精神疾病和身体疾病的发生[9]。对于人类的精神和身体，恐惧记忆都是一种伤害性刺激，适当的恐惧记忆可以帮助人们趋利避害，而紊乱的恐惧记忆和创伤后应激障碍等神经性疾病与恐惧记忆有着密切的关系。因此，深入探讨恐惧记忆形成的神经电机制，对于揭示恐惧记忆的神经信息处理模式和一些神经精神性疾病的病因及病理均有着重要的意义[10]。

已有研究表明，在中枢神经系统中，与恐惧记忆关系密切的脑区主要有海马、杏仁核、下丘脑、前额叶皮层及纹状体等部位[11]，但是有关恐惧记忆的形成对大鼠内侧前额叶皮层的局部场电位神经信息处理模式的研究较少。在学习和实验研究中，恐惧性记忆是常选择的记忆类型之一。恐惧性记忆的训练都使用较强的恶性刺激(如电击足底)，伴随的应激反应较强[12]。在本研究中，记录了大鼠恐惧记忆形成前后不同时间段内侧前额叶皮层的局部场电位信号，并对这些局部场电位信号进行了频带分析，揭示了恐惧记忆的形成对大鼠内侧前额叶皮层神经信息处理模式的影响。

1 实验对象与方法

1.1 实验动物

本实验样本量为8只健康雄性Sprage-Dawley(SD)大鼠(8～10周，体重300～350 g，购自上海斯莱克实验动物中心)。大鼠常规分笼饲养，自由饮水进食，自然光照，动物房内温度，在安静舒适条件下饲养适应1周。

1.2 实验仪器与试剂

微丝电极(直径为33 μm的镍铬合金丝，尖端裸露，自制)，Cerebus神经信号记录系统，手术显微镜，明暗穿梭箱，脑立体定位仪，牙托粉义齿基托树脂液剂，牙托粉，颅骨钻，碘酒，30%的双氧水，戊巴比妥钠。

1.3 微电极的植入

采用20 mg/kg剂量的戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后进行手术。大鼠自然俯卧并固定于脑立体定位仪上，消毒后切开大鼠头皮，进一步用30%的双氧水去除颅骨外的软组织，充分暴露出大鼠前、后囟及冠、矢状缝等骨性标志[13]。在前额叶皮层(前囟前方2.7～3.0 mm，旁开0.7～1.0 mm)用颅骨钻钻一小孔，在脑立体定位仪的引导下将微丝电极植入到内侧前额叶皮层(深度为3.0～3.7 mm)，电极用牙科水泥固定。缝合头皮，进行消毒预防术后感染。手术后恢复5～7 d，选取正常饮食、精神正常的大鼠进行下一步实验。

1.4 穿梭恐惧记忆形成训练方案

明暗穿梭箱由一个有机玻璃笼子(长36 cm，宽23 cm，高18 cm)以及嵌在底板上方的14根不锈钢棒和电源组成，其明箱和暗箱之间的通道能允许一只大鼠通过。大鼠穿梭恐惧记忆训练方案具体为：将大鼠置于明箱中，大鼠由于喜黑而很快地通过明箱和暗箱之间的通道进入到暗箱内；待大鼠四肢全部进入暗箱时，电源施加电压给钢棒，大鼠受到1.5 mA的足部电刺激而快速逃入明箱；足部电刺激多次，大鼠待在明箱中的持续时间超过30 min，即认为大鼠的恐惧记忆形成。明暗穿梭实验训练结束后，将大鼠移入饲养笼内。

1.5 局部场电位信号记录与分析

用Cerebus神经信号记录系统，记录清醒状态下大鼠恐惧记忆形成前以及恐惧记忆形成后6 h和1～6 d内侧前额叶皮层的局部场电位，幅值为100μV，采样频率为30 000 Hz，采样时间为10 min。采用Neuroexplorer软件去除50 Hz工频干扰，并分析局部场电位信号，频谱范围为0～100 Hz。各频段的频率范围为：δ波，1～3 Hz；θ波，4～7 Hz；α波，8～13 Hz；β波，14～30 Hz；γ波31～100 Hz。δ波通常产生在睡眠期间，是大脑皮层处于抑制状态的主要表现；θ波的出现，一般是中枢神经系统处于抑制状态的表现；α波是大脑皮层处于安静状态时电活动的主要表现；β波的出现，意味着精神状态比较兴奋；γ波的产生，与外界刺激的诱发有关[14]。局部场电位信号的分析指标为功率谱密度和功率谱中不同频段的功率百分比。采用Neuroexplorer软件分析采集到的局部场电位信号，并求出各频段信号的功率谱密度和功率，将每个频段信号的功率除以总功率，即可得各频段功率百分比。

1.6 数据统计

数据以均数±标准差表示，对不同时间状态下的局部场电位信号采用方差分析进行统计学处理，P<0.05，表示差异具有统计学意义。

2 结果

采用Cerebus神经信号记录系统，记录大鼠清醒状态下恐惧记忆形成前以及恐惧记忆形成后6 h和1～6 d内侧前额叶皮层的局部场电位信号。图1(a)为恐惧记忆形成前2 s内有代表性的内侧前额叶皮层的局部场电位原始信号，频谱范围为0～100 Hz，其他时间段局部场电位原始信号省略。对图1(a)采用Neuroexplorer软件，得到δ、θ、α、β、γ不同频段的局部场电位原始信号，如图1(b)～(f)所示。

图1 局部场电位信号。(a)局部场电位原始信号；(b)～(f)分别为δ、θ、α、β、γ频段的局部场电位原始信号Fig.1 Local field potential signals. (a) Raw local field potential signals; (b) - (f)Represent raw local field potential signals of δ, θ, α, β, γ frequency bands

2.1 恐惧记忆形成前后不同时间状态下的功率谱密度

图2是大鼠在清醒状态下恐惧记忆形成前后不同时间段局部场电位的功率谱密度。方差分析表明，恐惧记忆形成前后总功率无显著性差异(P>0.05)，详见表1。

图2 局部场电位的功率谱密度。(a)记忆形成前；(b)记忆形成后6 h；(c)～(h)分别为记忆形成后1～6 dFig.2 Power spectral density of local field potential. (a) Before the formation of memory; (b) Six hours after formation of memory; (c)-(h) 1-6 d after formation of memory

记忆时间记忆前记忆后6h记忆后1d记忆后2d记忆后3d记忆后4d记忆后5d记忆后6dP值F值总功率均值/dB-88584-88524-88514-88504-88504-88464-88504-88554总功率标准差/dB00001800901801801002101009970119

2.2 恐惧记忆形成后各频段功率百分比的变化特征

相对于恐惧记忆形成前，恐惧记忆形成后不同时间段各频段功率百分比的变化情况如图3所示(见下页)。α波在恐惧记忆形成前以及恐惧记忆形成后6 h和1～6 d，功率百分比和方差总体变化不明显，故在图3中省略。

不同时间状态下的各频段功率百分比以时间为变量进行方差分析，表2是恐惧记忆形成前的功率百分比分别与恐惧记忆形成后不同时间段的功率百分比两两组间进行方差分析得出的P值(见下页)。可见，恐惧记忆形成后6 h，θ和β波较恐惧记忆形成前功率百分比具有显著性差异(Pθ=0.017，Pβ=0.017)，恐惧记忆形成后1～2 d，δ和γ波较恐惧记忆形成前功率百分比具有显著性差异。

3 讨论

脑电图是脑生理特征的客观反应，是检验脑电生理变化的重要依据。但是，由于脑电图特殊的导联方式，信号记录需要受试对象头部处于静止的状态。在本实验中，大鼠处于清醒、自由的活动状态下，常规脑电图无法满足实验要求，因此采用植入式神经微电极，以保证记录电极与颅骨的位置相对固定，最大限度地减少因大鼠本身的行为造成电极与记录单元相对运动而产生的信号干扰，为揭示恐惧记忆对内侧前额叶皮层神经电信号的影响奠定了实验基础。

局部场电位是记录电极尖端附近局部区域的兴奋性和抑制性突触后电位的总和，是一类神经电活动协同作用的表现。局部场电信号的质量衰减缓慢，能够体现出较好的神经信息解码性能。功率谱是分析神经电信号的经典指标[15]，可以反映大脑在不同状态下脑电信号能量的大小以及各个频谱段上的分布情况。因此，本研究采用功率谱来反映局部场电位的变化特征。

图3 各频段不同时间段功率百分比(*表示与恐惧记忆形成前相比，P<0.05)Fig.3 The percentage of every band power at different times (* denotes compared with before formation of fear memory, P<0.05)

频段记忆形成后时间6h1d2d3d4d5d6dδ01710030∗0049∗0313034501870477θ0017∗037603980445013601170075α0213007404430219012001460424β0017∗017403520294035803580212γ01660013∗0019∗0498035104580468

注：与恐惧记忆形成前相比，*P<0.05。

Note: compared with before formation of fear memory,*P<0.05.

相对于其他脑区，δ波在前额叶脑区的含量比较高，因此本实验δ波的功率百分比较高。Makeig等的研究表明，大鼠在恐惧记忆形成1 d内，大脑处于高度警觉状态；而在恐惧记忆形成后2 d，警觉度下降[16]。有研究表明，随着警觉度的降低，δ波的脑电能量在整个脑区逐渐升高，而γ波的脑电能量在整个脑区逐渐降低。本实验的研究结果表明，大鼠在恐惧记忆形成后1 d内，δ波功率百分比呈下降趋势，而γ波则呈上升趋势，预示大鼠在恐惧记忆形成1 d内大脑处于高度警觉状态；在恐惧记忆形成后2 d，δ波功率百分比增大，而γ波减小，表明大鼠在恐惧记忆形成后2 d警觉度降低了。本实验的恐惧记忆训练采用电击足底的方法，属于伤害性刺激，且δ频段在恐惧记忆1 d内功率百分比显著降低。有实验结果显示，伤害性刺激会引起δ频段功率百分比明显降低[17]，这与本实验的结果一致。

一般认为，高幅度的慢波(δ或θ波)是大脑皮层处于抑制状态时电活动的主要表现。θ波属于低频节律波，有助于触发深沉记忆，强化长期记忆，与大脑记忆有着密切的关系。在本研究中，功率百分比在恐惧记忆形成后6 h显著增大，表明这时即处于短时恐惧记忆时期，大鼠的大脑兴奋性降低，大脑皮层处于抑制状态。有研究表明，大脑中电信号的节律成分对认知负荷比较敏感，脑接收刺激后前额叶皮层θ波能量会增加[18]，这与本实验结果一致。恐惧记忆形成的1～6 d，θ波段功率百分比随着记忆负荷的减小而减小。

有研究表明，β波与脑记忆能力有关，大鼠β波功率百分比的降低伴随着长时间记忆能力的损伤。在本实验中，恐惧记忆形成后6 h相对于恐惧记忆形成前β波是减小的，说明大鼠在短时恐惧记忆形成阶段记忆力下降了。恐惧记忆形成1 d后和恐惧记忆形成前无显著性差异，表明大鼠的长期记忆能力得到了恢复。本研究的实验结果显示，恐惧记忆训练后的3～6 d，各频段功率百分比和恐惧记忆形成前无显著性差异，表明恐惧记忆的形成对内侧前额叶皮层局部场电位的影响集中在6 h～2 d内，2 d后相应的影响就消退了。

4 结论

实验数据表明，大鼠内侧前额叶皮层的局部场电位恐惧记忆形成后6 h，θ波段和β波段较恐惧记忆形成前具有显著性差异；恐惧记忆形成后1～2 d，具有显著性差异的是δ和γ波段。实验结果表明，恐惧记忆的形成对内侧前额叶皮层神经信息处理的活动模式产生了显著性的影响。

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Effects of Fear Memory Formationon Local Field Potential in Rat Prefrontal Cortex

Zhang Bingshu Sui Li*Huang Sijia

(SchoolofMedicalInstrumentationandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

In this work, characteristics of local field potential before and after fear memory formation were studied to investigate the effects of fear memory formation on local field potential in rat medial prefrontal cortex. Eight healthy adult male SD rats were selected. The electrodes were implanted into the medial prefrontal cortex of the rats by stereotaxic apparatus. After one week, shuttle box test was used to induce fear memory in rats when rats were awake. The local field potential of rat medial prefrontal cortex was monitored by using Cerebus neural signals recording system, before and 6 h, 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d after fear memory formation. The Neuroexplorer software was introduced to analysis the local field potential. Power spectral density and power percentage of local field potentials were analyzed and compared with total power before and after the formation of fear memory and among different frequency bands (δ: 1-3 Hz, θ: 4-7 Hz, α: 8-13 Hz, β: 14-30 Hz, γ: 31-100 Hz). The results showed that the power percentage of θ and β at 6 h after fear memory formation was significantly different from that of before fear memory formation (P=0.017,P=0.017); The power percentage of θ was increased than that before fear memory formation. The power percentage of β was reduced than before fear memory formation. In addition, the power percentage of δ 1-2 days after fear memory formation was significantly different from that before fear memory formation (P=0.03,P=0.049). The power percentage of γ on 1～2 days after fear memory formation was significantly different from that before fear memory formation (P=0.013,P=0.019).These results indicated that activating mode of neural information processing in rat medial prefrontal cortex was significantly altered following fear memory formation.

medial prefrontal cortex; fear memory; local field potential; shuttle box test

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 01.007

2016-04-21， 录用日期:2016-10-17

国家自然科学基金(11179015，51173108)；上海理工大学科技发展项目(16KJFZ107)

R318

A

0258-8021(2017) 01-0053-06

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: lsui@usst.edu.cn