IgA肾病肾组织中OPN、TGF-β1的表达及其与临床、病理的关系

李海剑，程根阳，刘慧，李亦彤，陶雅非，王建刚，李玉东

（1.郑州大学附属南阳市中心医院 肾病风湿免疫科，河南 南阳 473009；2.郑州大学第一附属医院肾内科，河南 郑州 450052；3.郑州大学附属南阳市中心医院 心内科，河南 南阳 473009；4.华中科技大学同济医学院 第一临床学院，湖北 武汉 430030）

IgA肾病肾组织中OPN、TGF-β1的表达及其与临床、病理的关系

李海剑1，程根阳2，刘慧3，李亦彤4，陶雅非1，王建刚1，李玉东3

（1.郑州大学附属南阳市中心医院 肾病风湿免疫科，河南 南阳 473009；2.郑州大学第一附属医院肾内科，河南 郑州 450052；3.郑州大学附属南阳市中心医院 心内科，河南 南阳 473009；4.华中科技大学同济医学院 第一临床学院，湖北 武汉 430030）

目的探讨免疫球蛋白A（IgA）肾病肾活检组织中骨桥蛋白（OPN）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达及其与临床指标及组织病理的关系。方法应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法测定60例IgA患者，30例微小病变肾病（MCD）患者及20例正常肾组织肾组织中OPN、TGF-β1。同时测定各组血肌酐、肌酐清除率、24 h尿蛋白定量水平，应用Haas分型标准和Katafuchi分级对IgA患者进行病理评价，并分析肾组织OPN、TGF-β1与临床指标及病理的关系。结果IgA肾病组Haas各分型（Ⅰ～Ⅴ型）血肌酐、24 h尿蛋白定量及肾组织中OPN、TGF-β1表达水平高于MCD对照组和健康对照组（P<0.05），而肌酐清除率低于MCD对照组和健康对照组（P<0.05），其中Haas分型中Ⅳ和Ⅴ型肾组织中OPN、TGF-β1表达高于Ι、Ⅱ和Ⅲ型（P<0.05）。IgA肾病组Katafuchi分级（0～Ⅲ级）血肌酐、24 h尿蛋白定量及肾组织中OPN、TGF-β1表达水平高于MCD对照组和健康对照组（P<0.05），肌酐清除率低于MCD对照组和健康对照组（P< 0.05）。随着Katafuchi分级增加，IgA肾组织中OPN、TGF-β1表达水平升高（P<0.05）。经Spearman相关分析，IgA患者Haas分型、Katafuchi分级与肾组织中OPN、TGF-β1、24 h尿蛋白定量呈正相关（P<0.05）。结论OPN、TGF-β1参与IgA肾病肾小管间质损伤病理过程，是引起IgA肾病病情恶化的重要因素之一。

IgA肾病；肾活检组织；骨桥蛋白；转化生长因子；临床病理

免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）肾病是导致肾末期肾衰竭的重要因素，其临床病理特点表现为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）聚集、扩张及弥漫性系膜细胞（expansion and diffuse mesangial cells，MC）增生[1]。目前，肾小管间质损伤被认为是各种急慢性肾小球炎症的主要病理特征，是各类肾小球疾病发生的共同途径，极大地影响肾脏功能预后[2]。转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）可促进ECM蛋白合成、沉积及MC增殖，并参与肾间质纤维化及刺激肾小球硬化，从而促进肾纤维化形成[3]。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）属于多功能细胞外基质蛋白，在促进细胞黏附、聚集及介导炎症反应中起重要作用[4]。相关研究指出，无论在原发性或继发性肾小球肾炎中均可发现OPN表达水平升高[5]。因此，本研究将应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-perosidase，SP）观察IgA肾组织中OPN、TGF-β1的表达，并探讨其与临床指标、组织病理的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年6月-2016年6月在郑州大学附属南阳市中心医院经肾活检诊断为IgA肾病的60例患者作为IgA肾病组。纳入标准：①年龄>20岁；②经肾组织活检确诊；③患者均签署知情同意书。排除标准：①肝硬化、过敏性紫癜、乙型肝炎感染、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎及恶性肿瘤等系统性疾病引起的继发性肾小球疾病；②先天性遗传性肾脏疾病。其中，男性32例，女性28例；年龄22～58岁，平均（35.8±3.2）岁。选取30例经肾活检确诊为微小病变肾病（minimal change disease，MCD）患者为MCD对照组，排除标准与IgA肾病组相同。其中，男性18例，女性12例；年龄22～60岁，平均（35.9±3.4）岁；另选取肾脏肿瘤切除术后肿瘤周边正常肾组织20例为健康对照组。其中，男性12例，女性8例；年龄20～64岁，平均（36.2±3.5）岁，各组患者基线资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 测定各组临床指标 记录各组血肌酐、肌酐清除率、24 h尿蛋白定量水平，血肌酐由本院检验科按照Jaffe法测定，肌酐清除率按Cockcroft公式计算获得，24 h尿蛋白由实验室按考马斯亮蓝法测定。

1.2.2 肾组织OPN、TGF-β1测定 应用免疫组织化学法测定肾组织OPN、TGF-β1。将留取的IgA肾病和MCD患者肾活检组织及肿瘤周边正常组织行石蜡切片，乙醇梯度脱水，微波抗原修复，加入3%双氧水H2O23 ml灭活抗原30 min，三羟基甲胺-盐酸缓冲盐溶液（Tris-HCl buffer saline，TBS）冲洗3次，常温孵化30min，分别加入OPN一抗、TGF-β1一抗，4℃孵育过夜。三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）冲洗后，加入非生物素标记二抗，室温下孵化60 min，TBS冲洗3次，室温孵化 30 min，滴加二氨基联苯氨（Diaminobezidin，DAB）显色，显微镜下观察显色情况，苏木素对比染色，常规脱水，透明树脂封片。显微镜下将标本放大400倍摄取图像，肾小球数>8个/例，肾小管数>50个/例，肾小管随机视野10个/高倍镜，对所选视野阳性信号进行图像分析。计算每例切片中所有肾小球阳性面积占整个肾小球面积的均值，并以该值表示某种成分在肾小球中的相对表达量。计算肾小管间质着色面积占整个肾小管面积，并以该值表示某种成分在肾小管间质中的相对表达量。

1.2.3 IgA肾病病理评分标准 参照Haas法分为：Ⅰ型，轻微病变10例；Ⅱ型，部位节段肾小球硬化12例；Ⅲ型，局部性增生18例；Ⅳ型，弥漫性增生型12例；Ⅴ型，进行性慢性肾炎8例。Katafuchi分级：0级，无明显肾小间质病变22例；Ⅰ级，肾小间质病变面积<30%22例；Ⅱ级，肾小间质受累面积30%～70%10例；Ⅲ级，肾小间质受累面积>70%6例。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，做方差分析，两两比较采用LSD-t检验，相关分析用Spearman法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IgA肾病组Haas各分型OPN、TGF-β1及临床指标比较

IgA肾病组Haas各分型（Ⅰ～Ⅴ型）血肌酐、24 h尿蛋白定量及肾组织中OPN、TGF-β1表达水平与MCD对照组和健康对照组比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。IgA肾病组高于MCD对照组和健康对照组，而肌酐清除率与MCD对照组和健康对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），IgA肾病组低于MCD对照组和健康对照组。Haas分型中Ⅳ和Ⅴ型肾组织中OPN、TGF-β1表达与Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型比较，差异有统计学意义（P<0.05），IgA肾病组高于MCD对照组和健康对照组。见表1。

2.2 IgA肾病组不同肾间质病变分级 OPN、TGF-β1及临床指标比较

IgA肾病组Katafuchi分级（0～Ⅲ级）血肌酐、24 h尿蛋白定量及肾组织中OPN、TGF-β1表达水平与MCD对照组和健康对照组比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）；IgA肾病组高于MCD对照组和健康对照组。肌酐清除率与MCD对照组和健康对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），IgA肾病组低于MCD对照组和健康对照组。随着Katafuchi分级增加，IgA肾组织中OPN、TGF-β1表达水平升高，与对照组和健康对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2和附图。

2.3 IgA患者组织病理与肾组织OPN、TGF-β1及临床指标的关系

经Spearman相关性分析可知，IgA患者Haas分型、Katafuchi分级与肾组织中OPN、TGF-β1、24 h尿蛋白定量呈正相关（P<0.05）。见表3。

表1 IgA肾病组Haas各分型OPN、TGF-β1及临床指标比较 （±s）

表1 IgA肾病组Haas各分型OPN、TGF-β1及临床指标比较 （±s）

组别肾组织TGF-β1/%健康对照组（n=20） 45.98±2.56 130.58±3.22 1.42±0.36 2.42±0.34 3.12±0.48 MCD对照组（n=30） 46.22±5.69 129.96±6.48 1.43±0.45 2.58±0.45 3.09±0.52血肌酐/（μmol/L） 肌酐清除率/（ml/min）24 h尿蛋白定量/（g/d） 肾组织OPN/% IgA肾病组（n=60）HaasⅠ型（n=10） 69.96±6.78 109.12±5.02 1.82±0.69 8.63±0.63 9.28±0.71 HaasⅡ型（n=12） 68.22±8.69 107.47±9.11 2.02±0.72 8.78±0.72 9.32±0.82 HaasⅢ型（n=18） 68.36±9.82 105.25±10.32 2.62±0.75 8.92±0.82 9.98±0.93 HaasⅣ型（n=12） 105.98±11.96 70.63±9.78 3.59±0.82 12.69±0.89 12.02±2.02 HaasⅤ型（n=8） 128.22±13.58 63.66±12.45 4.22±1.02 13.78±0.96 12.39±2.33 F值 124.231 145.690 111.781 120.892 121.762 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 IgA肾病组不同肾间质病变分级OPN、TGF-β1及临床指标比较 （±s）

表2 IgA肾病组不同肾间质病变分级OPN、TGF-β1及临床指标比较 （±s）

组别肾组织TGF-β1/%健康对照组（n=20） 45.98±2.56 130.58±3.22 1.42±0.36 2.42±0.34 3.12±0.48 MCD对照组（n=30） 46.22±5.69 129.96±6.48 1.43±0.45 2.58±0.45 3.09±0.52血肌酐/（μmol/L） 肌酐清除率/（ml/min）24 h尿蛋白定量/（g/d） 肾组织OPN/%

续表2

附图 IgA肾病组不同肾间质病变分级OPN、TGF-β1的表达 （DAB染色×400）

表3 IgA患者组织病理与肾组织OPN、TGF-β1及临床指标的关系

3 讨论

IgA肾病是临床常见的原发性肾小球疾病。本研究发现，IgA肾病组Haas法分级提示为肾小球损伤，随着Haas分级增加，患者肾小球损伤程度明显增加。肾小管间质损伤被认为是肾小球疾病病情进展的重要表现，本研究中肾小管间质损伤发生率为63.33%（38/60），与健康对照组和MCD对照组比较，IgA肾病血肌酐水平、24 h尿蛋白定量增加，而肌酐清除率下降，且肾间质损伤程度与24 h尿蛋白定量呈正相关[6]。本实验结果与HARUHARA等[7]的研究一致。提示24 h蛋白尿可作为参与IgA肾病肾小管间质损害过程的重要致病因子，是引起IgA肾病恶化的重要因素之一。

OPN近年在肾脏疾病发生过程中所发挥的重要性逐渐被认识，本研究发现，在正常肾脏组织和MCD对照组中均有微量表达，而在IgA肾病肾小管中OPN蛋白表达水平上调，且随着肾小管间质病变程度加深，OPN蛋白表达水平升高[8-9]。CEN等[10]研究发现，IgA肾病近端小管及远端小管上皮细胞OPN表达水平显著上调，且上调程度与肾间质损害程度呈正相关。LANGDON等[11]在鼠间质性肾炎动物模型中发现，肾间质损伤区域肾小管上皮OPN蛋白表达水平显著升高，且OPN升高较24 h尿蛋白改变要早，因此可将OPN作为肾小管损伤的早期标志物。在本研究中，IgA患者肾小球损伤及肾间质损害程度与OPN呈正相关，提示OPN表达水平上调与IgA肾病病情进展关系密切。考虑其可能机制为OPN作为趋化分子及巨噬细胞黏附分子，可与整合素受体结合并介导巨噬细胞黏附及迁移，从而促进巨噬细胞到达肾间质，进一步介导肾间质炎症反应，加重肾间质损伤。

TGF-β1是由脂多糖及T淋巴细胞激活的单核-巨噬细胞分泌，属于促纤维化细胞因子，其在组织损伤初期具有促进组织再生及修复的作用，并在调节血管紧张素Ⅱ引起的血管平滑肌增生中起重要作用[12]。TGF-β1在IgA肾病病情进展过程中起重要作用，可参与IgA肾病患者ECM形成、系膜细胞增生、肾小管间质损伤等多种生理病理过程[13]。ZHANG等[14]指出，TGF-β1在调控IgA肾小球硬化及肾间质纤维化过程中发挥重要作用。本研究中，IgA患者肾组织中TGF-β1表达水平高于健康对照组和MCD对照组，且在HaasⅣ和Ⅴ型及KatafuchiⅠ～Ⅲ级患者中表达水平升高，且经Spearman相关分析可知，IgA患者Haas分型、Katafuchi分级与肾组织中TGF-β1呈正相关，提示肾组织TGF-β1表达水平升高与IgA肾组织病理损伤关系密切。考虑其可能机制为在肾间质损伤过程中，TGF-β1可通过刺激Ⅲ型胶原、蛋白多糖、纤连蛋白的表达，以及促进细胞外基质与细胞表面合成相关整合素，从而促使ECM生成及沉积进一步加重肾间质损伤[15]。

综上所述，OPN、TGF-β1参与IgA肾病肾小管间质损伤病理过程，是引起IgA肾病病情恶化的重要因素之一，因此可将OPN、TGF-β1作为IgA肾病肾小管损伤的早期标志物。

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（童颖丹 编辑）

Expressions of OPN and TGF-β1in renal tissue of patients with IgA nephropathy and their correlations with clinical and pathological parameters*

Hai-jian Li1,Gen-yang Cheng2,Hui Liu3,Yi-tong Li4, Ya-fei Tao1,Jian-gang Wang1,Yu-dong Li3
(1.Department of Nephrology and Rheumatology,Nanyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Nanyang,Henan 473009,China;2.Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China;3.Department of Cardiology,Nanyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Nanyang,Henan 473009,China;4.Department of Medical Imaging,the First Clinical College,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of osteopontin (OPN)and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in renal biopsy tissue of IgA nephropathy and their relationships with clinicopathological parameters.MethodsThe levels of OPN and TGF-β1in the renal tissues of 60 cases of IgA nephropathy,30 cases of minimal change nephropathy (MCD) and 20 people with normal kidneys were detected with immunohistochemical SP method.Serum creatinine,creatinine clearance and 24-h urinaryprotein were determined.Haas typing and Katafuchi grading were used to evaluate the pathological changes of IgA nephropathy patients.The correlations of OPN and TGF-β1in renal tissues with clinical parameters and pathological changes were analyzed.ResultsThe levels of serum creatinine and 24-h urinary protein,and the expressions of OPN and TGF-β1in the IgA nephropathy group of Haas typeⅠ-Ⅴ were higher than those in the MCD control group and the healthy control group,but the creatinine clearance was lower than that in the MCD and healthy control groups(P<0.05).The expressions of OPN and TGF-β1in the typeⅣ andⅤ renal tissues were significantly higher than those in the typeⅠ,Ⅱ andⅢ renal tissues (P<0.05).The levels of serum creatinine and 24-h urinary protein and the expressions of OPN and TGF-β1in the IgA nephropathy group of Katafuchi grade 0-Ⅲ were higher than those in the MCD control group and the healthy control group,while the creatinine clearance was lower than that in the MCD and healthy control groups(P<0.05). The expressions of OPN and TGF-β1in the renal tissue of IgA nephropathy group significantly rose with the increase of Katafuchi grade(P<0.05).The Spearman correlation analysis showed that Haas type and Katafuchi grade were in positive correlations with OPN and TGF-β1levels in the renal tissues and 24-h urinary protein in the IgA nephropathy patients (P<0.05).ConclusionsOPN and TGF-β1may play important roles in the pathogenesis of IgA nephropathy and renal tubulointerstitial injury.

IgA nephropathy;renal biopsy;osteopontin;transforming growth factor;clinical pathology

R692.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.012

1005-8982（2017）09-0059-05

2016-10-18

河南省科技攻关计划项目（No：152102310056）

程根阳，E-mail：chengrooter@163.com；Tel：0371-66295965