PRT318对胶原诱导人血小板Syk磷酸化的影响*

吴鸿，韩勇军，高水波，雷震，王振涛，韩丽华

（河南中医药大学 1.细胞成像实验室，2.心血管病研究所，河南 郑州 450002）

临床研究·论著

PRT318对胶原诱导人血小板Syk磷酸化的影响*

吴鸿1，韩勇军1，高水波1，雷震1，王振涛2，韩丽华2

（河南中医药大学 1.细胞成像实验室，2.心血管病研究所，河南 郑州 450002）

目的观察脾酪氨酸激酶（Syk）抑制剂PRT060318（PRT318）在体外对人血小板聚集率及Syk磷酸化的影响。方法采用比浊法测定PRT318对胶原、二磷酸腺苷（ADP）及花生四烯酸（AA）诱导的人血小板聚集率的影响；运用Western blot检测Syk525/6磷酸化水平。结果Syk特异性抑制剂PRT318可抑制胶原诱导的人血小板聚集率，但对ADP或AA诱导的人血小板聚集率无影响。在蛋白水平上PRT318可促进人血小板在胶原诱导下Syk525/6磷酸化水平升高。酪氨酸蛋白激酶抑制剂PP2可抑制胶原诱导的人血小板聚集，降低人血小板在胶原诱导下Syk525/6磷酸化水平，并可阻断胶原诱导下PRT318促Syk525/6磷酸化作用。结论PRT 318对胶原诱导的血小板聚集具有抑制作用，并能促进胶原诱导的血小板膜受体糖蛋白VI信号通路上Syk525/6磷酸化，提示PRT318可能通过作用于Syk525/6磷酸化而抑制血小板聚集。

PRT318；胶原；血小板集聚；Syk525/6磷酸化

在血小板参与止血、血栓形成过程中，血小板膜受体糖蛋白VI（glycoprotein VI，GPVI）是其中一个重要的受体，阻断GPVI下游信号通路能减少血栓形成，成为目前研发新型抗血栓药物的新靶点[1-2]。GPVI受体激活后，下游脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）磷酸化，血小板发生聚集，Syk在该过程中起重要作用[3-4]。Syk特异性抑制剂PRT060318（以下简称PRT318）在不同动物体内可抑制动脉血栓形成，表明Syk在血栓形成中起重要作用，而PRT318对胶原诱导人血小板Syk磷酸化水平的影响尚无报道[5]。本实验利用体外人血小板，观察PRT318对胶原诱导人血小板GPVI信号通路上Syk525/6磷酸化的影响。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

Syk抑制剂PRT318、Src家族激酶抑制剂PP2购于美国Selleck公司，胶原、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）及花生四烯酸（arachidonic acid，AA）购于美国Helena公司，兔抗p-Syk525/6和兔t-Syk抗体购于美国 Cell Signaling Technology公司。血小板来自本实验室健康自愿者静脉血。

1.2 血小板悬液制备

空腹静脉采血2 ml置于3.2%枸橼酸钠抗凝管中，室温下500 r/min离心10 min，取上清液，即为富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）。于PRP中加入阿司匹林（终浓度为1 mmol/L）防止血小板活化，37℃孵育30 min，室温放置5 min，3 000 r/min离心5 min，去上清液，用无Ca2+台氏液悬浮[无Ca2+台氏液组成：氯化钠NaCl 140 mmol/L，氯化钾KCl 5 mmol/L，氯化镁MgCl23.7 mmol/L，D-葡萄糖（D-glucose）2 mmol/L，羟乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES）10 mmol/L，pH=7.4]，调节血小板浓度至1×108个/ml备用。

1.3 血小板聚集率测定

为检测PRT318对胶原诱导血小板聚集率的影响，并验证PRT318对胶原作用的特异性，使用血小板聚集仪进行血小板聚集率的测定。血小板聚集仪（美国Helena公司）于实验前30 min开机预热，取专用比色杯，加入100 μl血小板，分别加入25 μl不同浓度的PRT318（终浓度分别为1.0、2.5和5.0 μmol/L）或PP2（终浓度分别为10.0、20.0和50.0 μmol/L），阴性对照组加入25 μl生理盐水。37℃孵育5 min，加入100 μl含Ca2+台氏液[含Ca2+台氏液组成：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，氯化钙CaCl22.5 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，D-glucose 2 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH 7.4]，轻轻混匀，再分别加入25 μl血小板激动剂胶原（终浓度为2.5 μg/ml）或ADP（终浓度为5.0 μmol/L）或AA（终浓度为500.0 μg/ml），在磁棒搅拌下（1 200 r/min）记录5min内血小板聚集过程及最大聚集率。

1.4 Western blot检测p-Syk525/6

本实验观察PRT318和Syk上游蛋白Src抑制剂PP2对胶原诱导人血小板Syk525/6磷酸化的影响。取100 μl血小板，加入不同浓度PRT318（终浓度分别为1.0、2.5和5.0μmol/L）或PP2（终浓度分别为10.0、20.0和50.0 μmol/L），37℃孵育5 min，加入胶原，37℃孵育、震荡3 min（转速1 200 r/min）。4℃下13 000 r/min离心2 min，弃去上清液，加入70 μl蛋白裂解液，提取总蛋白。聚氰基丙烯酸正丁酯法测蛋白定量，稀释后用5×SDS Buffer处理样品。配置10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分离胶和5%浓缩胶，取蛋白80 μg/孔上样，300 V恒压30 min。半干转转膜1 h，5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入抗体p-Syk525/6（1∶1 000）、t-Syk（1∶1 000），4℃孵育过夜。二抗37℃孵育1 h后，增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，凝胶成像系统采集图像并分析。

1.5 统计学方法

数据分析采用Graphpad prism 5统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRT318对胶原诱导血小板聚集率的影响

在胶原（2.5 μg/ml）诱导下，血小板集聚率升高。4组血小板集聚率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=622.183，P=0.000）。PRT318浓度为2.5和5.0 μmol/L时能抑制血小板聚集，且随浓度增加抑制作用越明显，与对照组比较，差异有统计学意义。见图1。

2.2 PRT318对ADP、AA诱导血小板聚集率的影响

ADP（5.0 μmol/L）和AA（500 μg/ml）均能有效诱导血小板集聚率升高。4组血小板集聚率比较，经方差分析，差异无统计学意义（F=0.202，P=0.892）。与对照组比较，PRT318（5.0 μmol/L）对ADP、AA诱导的血小板聚集率均无抑制作用，表明PRT318对血小板聚集率的抑制作用具有胶原诱导选择性。见图2。

2.3 PRT318对胶原诱导血小板Syk525/6磷酸化的影响

6组磷酸化水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=50.655，P=0.000）。在未加诱导剂胶原状态下Syk525/6处于低磷酸化水平，而10.0 μg/ml胶原可诱导Syk525/6磷酸化水平升高。与单纯使用胶原比较，浓度分别为0.5、1.0和2.5 μmol/L的PRT318对胶原（10.0 μg/ml）诱导的血小板Syk525/ 6磷酸化有促进作用。见图3。

2.4 不同浓度胶原对 PRT318作用的血小板Syk525/6磷酸化的影响

4组磷酸化水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=56.266，P=0.000）。在无胶原诱导下，PRT318（2.5μmol/L）对Syk525/6磷酸化无促进作用，而随着胶原浓度增加，Syk525/6磷酸化水平也逐渐增加，与对照组比较，差异有统计学意义。见图4。

2.5 PP2对胶原、ADP和AA诱导血小板聚集率的影响

6组血小板集聚率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=180.651，P=0.000）。与对照组比较，浓度为10.0、20.0及50.0 μmol/L的PP2能抑制胶原（2.5 μg/ml）诱导的血小板聚集率。其中，PP2浓度为50.0 μmol/L时对血小板聚集率的抑制作用最为显著。而50.0 μmol/L PP2对ADP（5.0 μmol/L）和AA（500 μg/ml）诱导的血小板聚集率无抑制作用。结果表明，PP2只通过GPVI信号通路对胶原诱导的血小板聚集率产生抑制效应。见图5。

2.6 PP2对胶原诱导血小板Syk525/6磷酸化的影响

5组磷酸化水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=10.966，P=0.001）。与单独应用胶原比较，浓度为10.0、20.0及50.0 μmol/L的PP2对胶原（10.0 μg/ml）诱导的人血小板Syk525/6磷酸化有抑制作用。见图6。

图1 PRT318对胶原诱导血小板聚集率的影响

图2 PRT318对ADP、AA诱导血小板聚集率的影响

图3 PRT318对胶原诱导血小板Syk525/6磷酸化的影响

图4 不同浓度胶原对PRT318作用的血小板Syk525/6磷酸化的影响

图5 PP2对胶原、ADP和AA诱导血小板聚集率的影响

图6 PP2对胶原诱导血小板Syk525/6磷酸化的影响

图7 PP2对PRT318促进胶原诱导Syk525/6磷酸化的影响

2.7 PP2对PRT318促进胶原诱导Syk525/6磷酸化的影响

4组磷酸化水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=42.983，P=0.001）。PRT318能升高胶原诱导的Syk磷酸化水平，不同浓度的PP2（10.0、20.0及50.0 μmol/L）对其均有抑制作用。见图7。

3 讨论

PRT318是近期发现的一种新型、特异性高的Syk抑制剂，但PRT318调节胶原诱导的人血小板GPVI信号通路Syk磷酸化的作用尚不清楚。本研究第一次发现，在胶原诱导作用下，PRT318可抑制人血小板聚集，在蛋白水平上升高Syk525/6的磷酸化水平。同时发现，在PRT318作用前提下，随着胶原浓度增加，Syk525/6磷酸化水平也随之增加，而在缺乏PRT318作用时，即使增加胶原浓度，Syk525/6磷酸化水平也未出现明显变化。

非常有趣的是，ANDRE等[5]研究发现，PRT318能够抑制人血小板Syk525/6磷酸化，与本实验结果相反。但无论是抑制或促进血小板Syk磷酸化，ANDRE小组研究结果与本研究结果相同的地方是PRT318对血小板聚集率都表现出抑制作用。分析其原因可能为以下几个方面：①所用血小板激动剂不同。ANDRE等[5]所用诱导剂为Convulxin（一种GPVI受体特异性激动剂），而本实验所用诱导剂为胶原，胶原受体除GPVI之外，还有糖蛋白Ⅰa/Ⅱa（glycoproteinⅠa/Ⅱa，GPⅠa/Ⅱa）。当胶原与GPVI、GPⅠa/Ⅱa结合后，外部信号传递至血小板内部[6-7]，尽管GPⅠa/Ⅱa在传递胶原信号由外到内的作用相对微弱，但分析其信号网络可能与Convulxin参与的信号网路不同，也可能是PRT318对Syk磷酸化水平发挥不同作用的主要原因；②所用防止血小板活化的预处理试剂不同。ANDRE等[5]使用糖蛋白Ⅱb/Ⅲa）抑制剂埃替非巴肽对血小板进行预处理，而本实验使用的是阿司匹林，两者作用部位不同；③激动剂诱导血小板活化的时间不同。Andre小组使用Convulxin诱导血小板1 min，本实验使用胶原诱导的时间为3 min。血小板在激动剂Convulxin刺激下，Syk会迅速磷酸化，在30 s时达到最高水平，但通路也很快启动去磷酸化，在60 s时Syk磷酸化水平已开始降低，在150 s时Syk磷酸化水平显著降低。而胶原对Syk磷酸化和去磷酸化的作用时间轴与Convulxin不尽相同，亦有可能对Syk磷酸化水平高低具有重要影响。有研究表明，若敲除Syk负调控基因TULA-2，则Syk磷酸化一直维持在较高水平[8-9]，因此分析PRT318在胶原作用下可能阻碍类似TULA-2该类具有去磷酸功能的蛋白与Syk相结合，使得Syk磷酸化保持高水平状态。但只有Syk磷酸化，不足以活化血小板，血小板仍保持圆盘状[10]，血小板集聚率仍处于较低水平，本研究结果也证明该点，也就是说即使PRT318促使胶原诱导的Syk磷酸化水平升高，但在PRT318作用下胶原诱导的血小板集聚率却处于低水平状态。

Src家族激酶Fyn和Lyn位于Syk上游，抑制Src激酶会抑制Syk激活以及Syk底物磷酸化[11-12]。本实验证实，Src特异性抑制剂PP2可抑制血小板聚集，并在蛋白水平上抑制Syk525/6磷酸化水平。在PP2作用下，PRT318对胶原诱导的Syk525/6磷酸化的促进作用亦被阻断，表明PRT318作用靶点是Syk蛋白磷酸化位点而不是其他。

综上所述，PRT318可有效抑制胶原诱导的血小板聚集，并能促进GPVI信号通路上Syk525/6磷酸化，PRT318作用靶点位于Syk蛋白磷酸化位点。今后尚需对PRT318在胶原诱导下是如何促进人血小板Syk525/6磷酸化水平升高的详细机制进行探索，并对Syk其他磷酸化位点的影响做进一步研究。同时需要研究在Syk抑制剂PRT318相互作用下同为GPVI受体激动剂的胶原和Convulxin对人血小板Syk磷酸化诱导作用差异化的原因，分析血小板活化的调控网络。

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（李科 编辑）

Effect of PRT318 on collagen-induced Syk phosphorylation in human platelets*

Hong Wu1,Yong-jun Han1,Shui-bo Gao1,Zhen Lei1,Zhen-tao Wang2,Li-hua Han2
(1.Laboratory of Cell Imaging,2.Institute of Cardiovascular Disease,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450002,China)

ObjectiveTo observe the effect of PRT060318 (PRT318),an inhibitor of spleen tyrosine kinase (Syk),on human platelet aggregation and Syk phosphorylationin vitro.MethodsThe effect of PRT318 on platelet aggregation induced by collagen,adenosine diphosphate (ADP)and arachidonic acid (AA)was measured by turbidimetry.The phosphorylation of Syk525/6 was detected by Western blot.ResultsThe Sykspecific inhibitor PRT318 suppressed collagen-induced platelet aggregation,while it did not have significantly inhibitory effect on ADP-or AA-induced platelet aggregation.The present data showed that PRT318 promoted the phosphorylation of Syk525/6 in collagen-induced platelets.PP2,tyrosine protein kinase (Src)inhibitor, inhibited collagen-induced platelet aggregation and decreased the level of Syk525/6 phosphorylation induced by collagen.PP2 also blocked PRT318-enhanced Syk525/6 phosphorylation in collagen-treated platelets.ConclusionsPRT318 significantly inhibits collagen-induced platelet aggregation and promotes collagen-induced phosphorylation of Syk525/6 locating in the downstream of glycoprotein VI (GPVI)signal pathway,suggesting that PRT318 may inhibit platelet activation through regulating Syk525/6 phosphorylation.

PRT318;collagen;platelet aggregation;phosphorylation of Syk525/6

R331.143

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.008

1005-8982（2017）09-0039-05

2016-12-13

国家自然科学基金（No：81072968）；教育部留学回国人员科研启动基金[No：教外司（20011568）]；河南省重点科技攻关项目（No：102102310334）

高水波，Tel：0371-60906297；E-mail：wuziao@126.com