俞氏灌肠方对溃疡性结肠炎大鼠肿瘤坏死因子及白细胞介素的影响*

叶 彬 来丽群

浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

实验研究

俞氏灌肠方对溃疡性结肠炎大鼠肿瘤坏死因子及白细胞介素的影响*

叶 彬 来丽群

浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

目的：观察俞氏灌肠方对溃疡性结肠炎模型大鼠的治疗作用以及对肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-10（IL-10）的影响。方法：48只SD大鼠随机分成俞氏灌肠方原剂量组、低剂量组、美沙拉嗪组、模型组各10只，空白对照组8只。予以三硝基苯磺酸建立模型后，分组灌肠给药2周后处死。观察其结肠组织学改变情况，并测定其血清TNF-α、IL-2、IL-10的含量。结果：①俞氏灌肠方原剂量组、低剂量组、美沙拉嗪组治疗后疾病活动指数（DAI）评分与模型组相比明显下降(P＜0.01)，且原剂量组评分下降较其他2组更为明显(P＜0.01)。②3个治疗组大鼠的组织学评分较模型组明显降低(P＜0.01)。③3个治疗组与模型组相比，血清TNF-α均有明显的降低(P＜0.01)，IL-2、IL-10有明显的升高(P＜0.01)；原剂量组血清IL-2升高更为明显(P＜0.01)。结论：俞氏灌肠方能有效缓解溃疡性结肠炎模型大鼠的肠道炎症，治疗作用与药物的浓度相关，其主要的优势在于能有效的提高IL-2水平。

俞氏灌肠方 溃疡性结肠炎 肿瘤坏死因子 白细胞介素 实验研究

溃疡性结肠炎(UC)是以侵犯大肠黏膜与黏膜下层为主的炎症性肠病，较容易出现迁延不愈或反复发作等情况。有研究表明，在过去20年内，我国UC的发病率增高了6倍[1]。故研究其发病机理，改善治疗方法，提高治疗效果十分必要。本研究观察全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师俞尚德的经验方俞氏灌肠方对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠UC模型的治疗作用及对肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-10（IL-10）的影响，以期系统、规范评价和确证俞氏灌肠方的疗效，部分揭示其治疗UC的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物：选择健康的SD大鼠48只，6周龄，体重120±20g，雌雄各半。由浙江省动物实验中心提供。随机分为5组，其中俞氏灌肠方原剂量组（以下简称原剂量组）、俞氏灌肠方低剂量组（以下简称低剂量组）、美沙拉嗪组、模型组，每组10只，正常对照组8只。

1.2 实验药物及试剂:5%三硝基苯磺酸（TNBS）购自浙江达文生物医药有限公司；俞氏灌肠方药物组成:蒲公英、黄芩、败酱草、红藤、丹参各30g，半边莲、半枝莲、生薏仁各20g，由杭州市中医院药剂科提供，并由制剂中心制备浓缩成1.05g/ml的灭菌原液。美沙拉嗪颗粒剂购自博福益普生（天津）制药有限公司，将1000mg颗粒剂磨成粉后，用灭菌蒸馏水溶解后稀释配制成5mg/ml的混悬液待用。大鼠IL-2，IL-10，TNF-α酶联免疫检测试剂盒购自R&D公司；水合氯醛、无水乙醇等购自杭州市中医院药剂科。

1.3 主要实验仪器:37℃恒温箱，微量移液器，京君龙实验仪器北京有限公司；全自动酶标仪（Bio-Tek ELX800）Bio-Tek，美国；低温离心机（3-18KS）Sigma，德国，切片机（RM2015），莱卡，德国；莱卡病理成像系统，LEICA，德国；BM-H型病理组织包埋机，安徽电子科学研究所；显微镜（BX51T-PHD-J11)，奥林巴斯，日本。

2 实验方法

2.1 UC大鼠模型的建立：动物分笼饲养，标准颗粒饲料，室温20±2℃，湿度40%～60%，光暗周期各12h环境饲养。造模采用较为常用的三硝基苯磺酸（TNBS）与乙醇联合诱导建立UC大鼠模型的方法[2]。3天后大鼠内出现腹泻、黏液脓血便后，证实造模成功。

2.2 分组给药方法:空白组正常喂养，模型组每天予以生理盐水0.4ml灌肠，原剂量组予以实验药物0.4ml灌肠，每日剂量为3.5g/kg；低剂量组以每日1.75g/kg的剂量灌肠；美沙拉嗪组则予以美沙拉嗪混悬液0.4ml灌肠，每日剂量为16.7mg/kg。

2.3 疾病活动指数(DAI)观察：每天大便性状、饮食、活动等情况，并应用联苯胺直接棉棒法晨测便潜血1次。对所有小鼠进行体重下降、大便性状、血便3方面的评分，评分标准为疾病活动指数(DAI)[3]。

2.4 动物标本的取材:于给药第2周末先腹腔注射水合氯醛麻醉后，剪开腹腔，于腹腔静脉处抽取静脉血2ml，分离出血清，-80℃保存。留取距肛2cm左右的结肠标本，观察形态，存于4%甲醛固定，送病理检测，对所有切片的病理组织学改变评分[4]。

2.5 统计学方法:应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。

3 实验结果

3.1 DAI评分:见表1。

表1 各组大鼠给药后DAI评分结果(±s，分)

表1 各组大鼠给药后DAI评分结果(±s，分)

注:与模型组比较，*P＜0.01；与原剂量组比较，#P＜0.01。

药后2周末0* 1.37±0.29 0.87±0.31*0.68±0.17*0.94±0.19*组别空白组模型组美沙拉嗪组原剂量组低剂量组只数8 10 10 10 10第3天0.37±0.16*2.20±0.76 1.97±0.56 2.09±0.49 2.13±0.32药后1周末0.13±0.08*2.17±0.77 1.23±0.33*#0.96±0.37*#1.52±0.42*#

3.2 结肠组织病理学观察:光镜下观察模型组组织学评分明显高于其他组（P＜0.01）；3个药物治疗组未见明显的溃疡及糜烂，低剂量组及美沙拉嗪组有少量的炎性细胞侵润，3组间比较无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠组织学评分结果(±s，分)

表2 各组大鼠组织学评分结果(±s，分)

注:与模型组比较，*P＜0.01。

组别空白组模型组美沙拉嗪组原剂量组低剂量组只数8 10 10 10 10组织学评分0.46±0.23*11.27±2.25 4.32±2.43*3.79±0.95*4.48±1.63*

3.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平:使用ELISA试剂盒测各组血清中TNF-α、IL-2、IL-10的含量。与模型组比较，各治疗组的血清TNF-α均有明显的下降，血清IL-2、IL-10有明显上升（P＜0.01）；原剂量组血清IL-2升高较剂量组及美沙拉嗪组更为显著（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平(±s)

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平(±s)

注:与模型组比较，*P＜0.01；与原剂量组比较，#P＜0.01。

组别空白组模型组美沙拉嗪组原剂量组低剂量组IL-10（pg/ml）42.7875±2.3666*29.5050±1.6745 35.6230±1.4176*36.7340±1.6425*32.9010±1.5968*只数8 10 10 10 10 TNF-α（ng/L）123.0925±6.1408*194.8680±9.3208 162.0880±5.6380*167.2370±7.6618*177.4660±4.6110*IL-2（ng/L）291.1488±10.4470*182.5520± 9.9620 237.8190±12.1858*#257.4040±11.5020*225.7950± 9.6816*#

4 讨论

关于溃疡性结肠炎的发病机制，近年来对免疫异常和炎性递质学说较为重视。目前根据细胞因子在炎症反应中所起的作用，将其分为两类，即促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等）和抗炎性细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β等）。肠道炎症的启动与进展，与这两组因子间的平衡失调有关[5]。

溃疡性结肠炎属于中医学中“泄泻”“痢疾”“便血”“肠风”等范畴[6]。本病的病机为湿热久稽，蕴结大肠，热入营血，大肠血络受损。俞氏灌肠方中蒲公英清热解毒，为君药；黄芩、败酱草清瘀排脓为臣药；半枝莲、半边莲消肿解毒，生薏仁化湿健脾，红藤、丹参活血通络共为佐药。诸药合用共奏清热解毒、消肿散瘀、祛湿化浊之功效。

本实验结果显示，俞氏灌肠方原剂量组UC大鼠的一般状况、结肠表现及病理表现比模型组有明显的改善，其症状改善的速度较低剂量组及美沙拉嗪组有明显的优势；且原剂量组大鼠TNF-a水平明显下降，IL-2、IL-10的水平有明显升高，上调IL-2的作用较为显著。上述结果说明，俞氏灌肠方能迅速的减轻UC的症状，减少肠道炎症，促进溃疡愈合，其作用程度与药物的浓度相关，其作用机理与调节细胞因子间的平衡有关。与美沙拉嗪相比较，其主要的优势在于提高IL-2的水平。

[1]Chow DK，Leonq RW,Tsoi KK．Long-term follow-up of ulcerative colitis in the Chinese population[J]．Am J Gastroenter,2009,104(3):647-654．

[2]葛翠翠，王慧娜,杜丽欣，等.炎症性肠病小鼠模型的建立及其影响因素探讨［J］.生物技术通讯，2013，24（4）:514-518.

[3]Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65)antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis[J]. Clin Exp Immuno，2000，120(1):51-58.

[4]Ekstrom GM．Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide，cyclosporine A，and 5-aminosalicylic acid[J].Scand J Gastroenterol，1998，33(2):174-179.

[5]樊慧丽，陈玉梅.溃疡性结肠炎的发病机制和治疗进展[J].中国全科医学.2012,15(2):228-230.

[6]孙利丽.近5年中医治疗溃疡性结肠炎组方用药规律分析[J].浙江中医杂志,2013,48(5):382-383.

2016-09-22

浙江省中医药科技计划项目基于细胞因子网络探讨俞氏灌肠方灌肠对溃疡性结肠炎大鼠模型的影响，编号：2013ZA092