木贼药材HPLC指纹图谱及质量评价研究*

汪 霞刘兵兵张庆英姚 冲

1 浙江省长兴县中医院 浙江 长兴 313100 2 山东省聊城职业技术学院 山东 聊城 252000 3 浙江省湖州市中心医院 浙江 湖州 313000

中药研究

木贼药材HPLC指纹图谱及质量评价研究*

汪 霞1刘兵兵1张庆英2姚 冲3#

1 浙江省长兴县中医院 浙江 长兴 313100 2 山东省聊城职业技术学院 山东 聊城 252000 3 浙江省湖州市中心医院 浙江 湖州 313000

木贼 指纹图谱 高效液相色谱 质量评价

木贼药材为木贼科植物木贼的干燥地上部分。目前，药典收载正品木贼有1种，常见混淆品种有问荆、笔管草、节节草[1-2]。本文对市面上销售的10批木贼药材样品进行指纹图谱研究，并建立了相应木贼药材HPLC指纹图谱评价方法，为评价药材质量提供可靠实验依据。

1 试药与仪器

1.1 试药:供含量测定用的对照品山柰素（中国食品药品检定研究院，批号:110861-201310）、山柰酚-3，7-双葡萄糖苷、山柰酚-3-双葡萄糖-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-双葡萄糖苷（自制，其化学结构经MS，1H-NMR，13C-NMR和DEPT谱确证，面积归一化法检测纯度大于98%）。甲醇、乙腈均为色谱纯，美国Dima公司；冰醋酸、磷酸均为分析纯；水为自制纯净水。木贼药材经长兴县中医院郭小元中药师鉴定其原植物为木贼科木贼的干燥地上部分，药材来源及产地见表1。

表1 木贼药材样品来源

1.2 仪器:惠普1100型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵，在线脱气机，柱温箱，二级管陈列检测器；CP225D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件:色谱柱:YMC-Pack ODS-A（150mm× 4.6mm，5μm）；流动相:甲醇（A）0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5min，0%A；5～20min，0%→20%A；20～30min，20%A；30～55min，20%→70%A）；流速:0.8ml/min；检测波长:295nm；柱温:35℃；进样量:10μL。理论板数按山柰素峰计算应不低于3000。

2.2 混合对照品溶液的制备:取山柰酚-3，7-双葡萄糖苷、山柰酚-3-双葡萄糖-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-双葡萄糖苷和山柰素对照品适量，精密称定，用50%甲醇超声溶解，配置成浓度分别为 27.95，45.22，32.12，56.95μg/mL的混合对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备:取木贼样品粗粉0.2g，煎煮2次，每次加水800ml，第1次2小时，第2次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约50ml，放冷，加入乙醇使含醇量达70%，放置36小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，放冷，加入乙醇使含醇量达80%，放置36小时，滤过，用40%氢氧化钠溶液调节PH值至8.0，放置36小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，冷藏36小时，加入活性炭，在110℃加热40分钟，放冷至室温，滤过，滤液置50ml量瓶中，加流动相溶液至刻度，摇匀，再用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察:分述如下。

2.4.1 精密度试验:精密称取木贼药材(编号S2) 0.2g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图峰面积及保留时间，结果表明其相对峰面积的RSD为0.23%，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.16%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验:精密称取木贼药材(编号S2) 0.2g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、1、2、4、6、8、12、24h进样，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD为1.02%，各色谱峰的相对峰面积的RSD为2.3%，表明处理后的供试品溶液在24h内基本稳定。

2.4.3 重复性试验:精密称取木贼药材(编号S2)0.2g共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，考察方法的重复性。结果表明其相对峰面积的RSD为1.3%，各色谱峰相对保留时间的RSD为2.8%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立:指纹图谱及共有峰的标定取自不同来源的10批次木贼药材，按“2.3”方法制备供试品溶液，照“2.1”条件进行测定分析。通过比较各批次药材色谱图，确定22个特征峰，将HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系2004A版》软件，建立木贼药材指纹图谱。将化学信息较多的S1号样品设为典型色谱图，与混合对照品图谱对照，指认其中4个色谱峰，分别为山柰酚-3，7-双葡萄糖苷（9号峰）、山柰酚-3-双葡萄糖-7-葡萄糖苷（11号峰）、山柰酚-3-双葡萄糖苷（13号峰）和山柰素（21号峰），在各批次样品图谱中山柰酚-3，7-双葡萄糖苷的色谱峰分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定9号峰为参比峰。

2.6 相似度评价:采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对10批木贼样品的HPLC指纹图谱进行相似度评价，S1～S10木贼样品相似度评价结果分别为0.982、0.963、0.954、0.953、0.963、0.959、0.968、0.986、0.978、0.971，分析结果显示10批木贼相似度均在0.950以上，表明各产地木贼具有较高的相似度。

2.7 化学模式识别:分述如下。

2.7.1 系统聚类分析:将各色谱峰相对于内参比色谱峰的峰面积量化，运用SPSS统计分析软件对其进行系统聚类分析，采用欧氏距离作为样品的测度，见图1。根据图3可以看出10批木贼药材可以分为三大类，S2、S4、S5、S6聚为一类，S1、S7聚为一类，其余聚为一类。参照样品产地，S2、S4、S5、S6的产地集中在东北地区。

图1 木贼样品聚类分析结果

2.7.2 主成分分析:10批木贼药材样品经上述实验获得各批样品的色谱数据，HPLC图谱各共有峰的峰面积相对药材称样量之比，即单位质量药材峰面积进行量化，得到10×22阶的数据矩阵，采用SPSS软件对矩阵进行分析，以主成分PC1和PC2所组成的维投影图见图2。10批木贼样品分组结果与聚类分析结果相一致。

图2 主成分分析平面投影图

3 讨论

目前，2010版《中国药典》对于木贼的含量测定是将木贼甲醇提取物进行酸水解，以苷元山柰素作为对照品。文献报道的木贼成分测定方法多以苷元山柰素为指标性成分[3-4]，而以黄酮苷作为木贼的质量评价指标的研究报道不多[5]。本实验采用以水溶性苷类成分为主的木贼药材指纹图谱方法，从活性成分和“活性物质群”角度来评价木贼品质优劣。研究结果显示梯度洗脱分析耗时短，并且22个特征成分获得较好的分离度，且酸性缓冲体系可明显改善具有弱酸性酚羟基的黄酮醇类成分的分离效果和峰形。另外，研究还发现在295nm处指纹图谱色谱峰具有良好峰形，且基线平稳，因此选用295nm作为木贼指纹图谱的检测波长。本实验表明10批木贼药材的化学成分组成较一致，批次间各成分种类高度相似而含量的有一定差异。聚类分析结果表明于不同地方购买的药材其产地可能相近或相同，这也与主成分分析分组相一致，应用系统聚类分析和主成分分析2种化学计量学方法对木贼色谱积分数据进行了模式识别的探讨，两者判断结果基本一致。

[1]刘振启，刘杰.木贼与混乱品的鉴别[J].首都食品与医药，2015，22(13):55.

[2]张浩，张舒娜，邵财，等.木贼科木贼与节节草不同居群形态多样性分析[J].吉林中医药，2015，35(7):707-709.

[3]张宪，赵惠萍，张小茜，等.木贼质量标准的研究[J].中国中医药信息杂志，2005，12(5):48-50.

[4]郦红岩，汤小伟，周坚祥，等.HPLC法测定木贼中槲皮素和山柰素的含量[J].药学研究，2012，31(7):400-401.

[5]赵磊，李冲，张承忠，等.木贼中三种黄酮苷的含量测定[J].中国现代应用药学，2005，22(2):159-161.

2016-06-13

浙江省中西医结合学会临床药学科研专项基金项目基于RWS的丹参多酚酸盐临床使用情况及安全性评价，编号：2013LYSX015；浙江省药学会医院药学科研专项基金项目基于RWS的丹参多酚酸盐基层医院用药评价与分析，编号：2013ZYY17

# 通讯作者：姚 冲，E-mail：hzszxyy@foxmail.com