雄激素受体在大鼠睾丸中转录模式的分析*

于泊洋， 张 磊， 杨 铮， 刘陶迪

(内蒙古医科大学心身医学研究室， 呼和浩特 010110)

雄激素受体在大鼠睾丸中转录模式的分析*

于泊洋， 张 磊， 杨 铮， 刘陶迪△

(内蒙古医科大学心身医学研究室， 呼和浩特 010110)

目的：研究Ar(雄激素受体)基因在大鼠睾丸组织中的转录模式。方法：取刚出生的雄性Wistar大鼠，于出生2～65日的不同时间点，脊椎脱臼处死3只不同窝别的幼鼠，提取睾丸组织总mRNA；将mRNA反转录成cDNA，随后采用Real-time PCR方法检测大鼠睾丸组织中Ar mRNA的转录情况。结果：Ar mRNA表达在出生后第2天开始缓慢上升到第16天达到最高值，第16天到第30天迅速下降，第31天出现一个小高峰后到第65天持续缓慢下降。结论：Ar基因在大鼠早期发育睾丸组织中表达量逐渐升高，可能与精原干细胞的增殖及初级精母细胞的发生相关。

雄激素受体; 精子发生; 精原干细胞; 初级精母细胞; 大鼠

androgen receptor; spermatogenesis; spermatogonial stem cells; primary spermatocyte

【DOI】 10.12047/j.cjap.5467.2017.041

据世界卫生组织(WHO)估计，10%的已婚夫妇患有不育症，其中男性因素约占50%，其中因无精子症或严重少精子症所引起的男性不育占11.2%[1]男性不育症已经是人类生殖研究的重要课题。目前男性生殖医学的基础研究还无法满足临床诊治的需求，因此必须大力加强生殖医学的基础研究, 以解决男性不育患者的临床诊治问题。导致男性不育的原因非常多，其中精子发生过程中基因缺陷可导致精子发生障碍，随着分子生物学技术的发展与广泛应用，男性不育症的研究也深入到分子水平，研究精子发生分子机理是解决男性不育的重要分支[2]。

睾丸是精子发生的场所，精子发生是由数量众多的基因协同控制的复杂的细胞分化过程，这一过程的每一阶段都受到众多基因的共同作用。而根据Wrobel G等[3]研究结果显示，大鼠睾丸的基因转录表达过程为：出生后0～8 d主要以精原干细胞的自我更新和分化为主；出生后14 d左右减数分裂开始，此时初级精母细胞出现；出生20 d之后进入圆形精子发生阶段，第二次减数分裂刚刚完成，此时圆形精子首

次出现；出生35 d后完成圆形精子向长形精子的变形，成熟的精子出现；出生56 d后大鼠性成熟，达到成年状态[3,4]。

Ar是近些年来生殖生物学与生殖医学研究的热点之一, 体内外形态与细胞水平研究结果表明, 该受体与精子发生密切相关[5-9]。AR属于核受体超家族中的类固醇受体。AR一般由四个结构域组成:N端转录激活区(N transcription activation domain, NTD)、DNA结合区(DNA binding domain,DBD)、铰链区(hinge region,HJ)和配体结合区(ligand binding domain, LBD)。雄激素受体是雄激素作用的中介物质。雄激素受体为分子量120 000道尔顿的蛋白质，在人体的X染色体的基因指导下合成，与雄激素结合的单聚体(4.4S)在细胞中与受体蛋白及一个产生9S无活性的小分子单聚体结合[6,10]。

本研究选用2～65日龄的雄性大鼠睾丸组织，提取其总mRNA并反转成cDNA，采用Real-time PCR进行mRNA水平检测Ar基因在大鼠睾丸组织中的表达，为进一步研究Ar在精子发生过程中的功能提供依据, 并为进一步对Ar相关疾病的发病机制及寻求解决方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，反转录及实时定量PCR试剂均购自大连宝生物公司，引物均由上海生物工程公司合成。

1.2 实验动物

购买育龄Wistar大鼠，将一只雄鼠与两只雌鼠合笼(内蒙古大学实验动物中心购买)，自然交配。内蒙古医科大学基础实验楼分子生物学实验室饲养，每周换垫料一次，保证饲料和饮水的清洁和充足。记录鼠出生的具体时间。出生当天计第一天。饲养，足够日龄后处死，立即取下睾丸组织样品，立刻放入-80℃低温冰箱中冷冻储存备用。

1.3 实验样本采集

以出生当天计第一天，将出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65日龄的雄性大鼠脊椎脱臼法处死，取睾丸组织立刻放入-80℃低温冰箱中冷冻储存备用。每个时间点3只不同窝别的大鼠。

提取组织总RNA，取约50 mg睾丸组织，加入裂解液1 ml，先加300 μl将组织剪碎，再加700 μl用一次无菌性注射器冲打混匀，充分裂解后，采用总RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP419)按照使用说明书进行操作。提取完成后分装出2 μl用紫外分光光度仪测定RNA浓度(Conc)和纯度(A260∶A280比值)，以A260/A280接近2.0为合格。将提取的各样品总RNA置于-80℃冰箱中保存备用。一周内进行反转录。

1.4 RNA逆转录为cDNA

根据各样品总RNA的浓度和纯度值，将样品稀释成终体积为30 μ1，浓度为0.2 μg的稀释液，取相同体积的各组样品进行反转录反应。反转录体系为20 μl：A液10 μl：样品总RNA 4 μl，Oligo(dT)(10 μmol/L)1 μl，Rnase-Free dH20补齐至10 μl；B液10 μl：5×M-MLV buffer 4 μl，dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μl，RNase Inhibiter(40 U/μl)1 μl，M-LV Reverse Transcriptase(5 U/μl)0.5 μl，RNase．Free ddH2O 2.5 μl。反应条件为：A液65℃水浴5 min，将A液与B液混合，涡旋离心后，42℃水浴60 min，72℃水浴10 min。将mRNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

1.5 Ar基因引物设计

引物序列表见表1。

Tab. 1 List of oligonucleotide primers

1.6 Real-time PCR方法检测Ar的转录表达

利用M-MLV反转录酶以1.0 μg RNA模板反转录合成cDNA第一链，分别取大鼠出生第2、4、6、8、l0、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天21个cDNA模板样品进行Ar基因的实时定量PCR反应检测，使用SYBR Prelnix Ex TaqTM试剂盒进行Real-time PCR反应。根据试剂盒说明及引物的条件设定实时荧光定量PCR的反应程序。每个时间点的实时定量PCR检测在实时PCR检测仪上重复两管。用GAPDH做内参对照，用H2O做阴性对照。采用Ct方法分析Ar mRNA的表达量，结果用基因mRNA相对表达倍数表示，计算方法用2-△△Ct法，数据和图表使用Microsoft Excel 分析[11]。

2 结果

2.1 Real-time PCR检测Ar基因在三组不同窝别大鼠早期发育睾丸组织中mRNA水平的表达情况

根据引物的溶解曲线可知，其特异性好(图1 A，C)。扩增曲线在PCR平台期几乎重合(图1 B，D)。

通过Real-time PCR反应检测到Ar基因在三组不同窝别的大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天睾丸组织中的表达模式(图2)，三组不同窝别的大鼠睾丸组织mRNA水平表达趋势基本一致；第2～65天的大鼠睾丸组织mRNA表达差异明显。Ar mRNA表达在出生后第2天开始缓慢上升到第16天达到最高值，在第16天到第30天迅速下降，第31天出现一个小高峰之后到第65天持续缓慢下降。其中出生第16天为大鼠睾丸组织Ar 基因mRNA表达峰值。

Fig. 1 Dissolution profile and amplification curve of Ar and GAPDH A: Dissolution profile of Ar; B: Amplification curve of Ar; C: Dissolution profile of GAPDH; D: Amplification curve of GAPDH

Fig. 2 The mRNA expression of cxcl6 gene in 3 different nest on post-natal days 2,4,6,8,10,12,14,15,16,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65

3 讨论

在精子发生的整个过程中精原干细胞需通过3个阶段成为成熟精子：第一阶段，精原干细胞位于生精上皮的基底部，根据其命运分为暗型精原细胞(dark type A，Ad)和亮型精原细胞A(pale type A, Ap)两种不同的类型。在正常情况下，Ad型精原细胞仅发生有丝分裂进行增殖而作为精原干细胞的储备；而Ap型精原细胞一般分裂为两个B型精原细胞，进一步分裂增殖为次级精母细胞。第二阶段，精母细胞经历两次减数分裂，第一次减数分裂后产生初级精母细胞。次级精母细胞在第二次减数分裂后变为单倍体的圆形精子细胞。第三阶段：圆形精子细胞经过一系列复杂的生化变化，细胞核发生聚缩和塑性，同时顶体和鞭毛形成，胞浆明显扩张，最终转变为长形的成熟精子[12-14]。总之，精子发生主要分为3个阶段：精原干细胞的自我更新与分化阶段，减数分裂阶段和精子生成阶段[15-17]。

研究表明, Ar与男性精子生成障碍有密切关系[5-9], 精子发生的启动和维持需要依赖下丘脑一垂体一睾丸轴的功能。体内环境下,睾酮通过Ar的介导直接作用于支持细胞发挥作用,当Ar与配体结合后,空间构象发生变化而发生活化,活化后的Ar以二聚体的形式与靶细胞核中的雄激素效应元件结合,并使其转录因子相互作用,从而调节靶基因表达,产生效应[18]。但Ar在精子发生的哪些阶段发挥作用及如何发挥作用尚未见报道。

本实验室前期研究发现，出生后2～10 d为大鼠青春前期精原干细胞发生的关键时期，出生15 d前后为大鼠精母细胞发生的关键时期，出生30 d前后为大鼠圆形精子发生的关键时期[18]。本实验通过对Ar基因在大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的表达模式的检测，可以看到，Ar基因在大鼠出生早期，转录水平是呈现动态变化的，在我们的研究中，Ar mRNA表达在出生后第2天开始缓慢上升到第16天达到最高值，在第16天到第30天迅速下降，第31天出现一个小高峰之后到第65天持续缓慢下降。其中出生第16天为大鼠睾丸组织Ar 基因mRNA表达峰值。

刘陶迪等[19]主要以出生第2天至第30天大鼠的睾丸组织为研究对象，研究精子发生早期相关的关键基因的表达。对大鼠早期发育睾丸组织精子发生的基因进行差异性表达分析，结果在大鼠出生后第6天至第10天期间，精原干细胞标志性基因CDH1的mRNA转录水平呈现显著变化，表明该时期是大鼠精原干细胞的增殖分化的关键时期。Ar mRNA水平从出生第2～8天缓慢上升，这一时期为精原干细胞增殖期，可据此推测Ar在精原干细胞的增殖过程中发挥一定的作用。Ar mRNA水平的这种缓慢上升趋势从第8天继续持续到第16天，根据Wrobel G等的研究结果，这一时期为初级精母细胞的形成期，我们可以推测Ar可能参与初级精母细胞的生成过程。在第16天达到峰值后Ar mRNA水平开始下降，表明从第一次减数分裂以后，Ar在圆形精子的形成等过程中不再发挥明显的作用。

我们将Ar基因做mRNA转录表达水平的检测，3组不同窝别的Ar基因mRNA表达水平基本一致，随着大鼠早期精子发生的进行，2～65 d呈现不同的表达水平，表达量的高低及对应的出生时间点表明Ar基因可能参与精原干细胞的增殖及初级精母细胞的发生。通过以上结果我们得到如下结论：(1)Ar基因表达与精子发生具有一定的相关性。(2)Ar基因在大鼠早期发育睾丸组织中表达量逐渐升高，与精原干细胞的增殖及初级精母细胞的发生相关。以上结果为进一步研究Ar在精子发生过程中的功能提供依据, 并为进一步对Ar相关疾病的发病机制及寻求解决方法提供依据。

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2016-06-27

2016-12-14

R73-3

A

1000-6834(2017)02-163-04

△【通讯作者】Tel： 13848129859； E-mail： taodiliu@163.com