以脑源性神经营养因子等干预视神经损伤大鼠视神经应力松弛特性分析

王 玲,李 鹏,姜 琦

(1.吉林大学中日联谊医院 眼科，吉林 长春130033;2.吉林大学南岭校区 工程力学系，吉林 长春130022;3.吉林大学中日联谊医院 肾病科，吉林 长春130033)

以脑源性神经营养因子等干预视神经损伤大鼠视神经应力松弛特性分析

王 玲1,李 鹏2,姜 琦3*

(1.吉林大学中日联谊医院 眼科，吉林 长春130033;2.吉林大学南岭校区 工程力学系，吉林 长春130022;3.吉林大学中日联谊医院 肾病科，吉林 长春130033)

视神经损伤是以药物治疗、手术治疗，还是以糖皮质激素治疗，仍存在着较大的争议[1]。近期视神经损伤以干细胞移植治疗已在动物实验中取得了一定的进展[2]。干细胞移植治疗视神经损伤很可能成为一条崭新的途径[1]。关于以人脐血干细胞hUCBSC(human umbilical cord blood stem cells)干预治疗视神经损伤，周丹[3]以人脐血干细胞干预治疗大鼠外伤性视神经部分损伤进行了研究，得出了联合使用人脐血干细胞和神经营养因子可以促进神经传导功能恢复的作用，神经营养因子、人脐血干细胞、神经营养因子联合人脐血干细胞对大鼠外伤性视神经部分损伤后视神经传导功能的恢复具有促进作用的结论。Zhao和Gluckman等[4,5]的研究结果表明，通过向动物眼玻璃体腔注射hUCBSC 可以在一定程度上起到修复TON,减缓RGC 进行性死亡，减少视功能丧失的作用。李云琴等[1]观察了以人脐血干细胞hUCBSC干预视神经损伤动物模型后的效果， 研究发现，以人脐血干细胞移植后，对SD 大鼠部分受损的视网膜神经节细胞( retinal ganglion cells，RGC) 具有保护的作用，得出了向视神经损伤大鼠玻璃体腔注射hUCBSC 可减缓视网膜中RGC 的凋亡，对RGC 具有一定的保护作用的结论。

关于人脑源性神经营养因子干预治疗视神经损伤动物模型，刘勇等[6]对-绿色荧光蛋白(GFP)基因神经干细胞、转染人脑源性神经营养因子(brain—derived neurotrophic factor，hBDNF)干预视神经损伤大鼠hBDNF、 GFP在视网膜内的存活、迁移和分化情况和对视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)存活的影响进行了研究，得出了移植后的hBDNF—GFP—NSCs可少数可分化为视网膜神经节样细胞；还可以分化为神经元和神经胶质细胞，移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs的存活数17的结论。关于视神经动物模型以药物治疗后的生物力学实验研究，Jiang等[7]复制家兔视神经损伤模型，分别以重组人睫状神经营养因子、以中药复光颗粒、重组人睫状神经营养因子联合中药复光颗粒进行干预治疗后取各组视神经进行拉伸实验，结果表明，中药复光颗粒、重组人睫状神经营养因子、中药复光颗粒联合重组人睫状神经营养因子干预组拉伸力学性能指标均大于视神经损伤模型组，差异显著(P<0.05).得出了视神经损伤模型以重组人睫状神经营养因子、中药复光颗粒、中药复光颗粒联合重组人睫状神经营养因子干预治疗后，动物视神经的拉伸力学性能指标均有一定的恢复的结论。对视神经损伤动物模型以脑源性神经营养因子、人脐血干细胞干预治疗后视神经的应力松弛分析鲜有报道，鉴于视神经损伤治疗的需要，本实验分别以脑源性神经营养因子和人脐血干细胞干预治疗视神经损伤动物模型后进行应力松弛实验，以应力松弛特性指标研判人脐血干细胞、脑源性神经营养因子干预治疗视神经损伤大鼠的疗效，旨在为临床治疗视神经损伤提供应力松弛力学特性参数。

1 材料与方法

实验大鼠：6月龄雄性SD大鼠60只,体质量320-330 g，购于吉林大学实验动物部。实验前通过腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg麻醉大鼠，检查大鼠外眼及眼底有无病变，对无病变大鼠纳入实验。动物饲养室温度22-25℃，自然光照，每天光照12小时，室内空气流通，相对湿度58-71%，大鼠在笼中自由摄食饮水。60只大鼠随机分为视神经损伤以BDNF干预组20只，视神经损伤模型组20只、视神经损伤模型以人hUCBSC干预组20只，在各组大鼠中随机取20只大鼠正常眼(右眼)为正常对照组。

药物：脑源性神经营养因子(BDNF)，上海酶联生物科技有限公司(上海，中国)人脐血干细胞(hUCBSC)，深圳北科生物公司生产(深圳，广东省，中国)。

大鼠视神经损伤模型的复制：按参考文献[7]的方法复制大鼠视神经损伤模型，将大鼠俯卧位固定于手术台上,向大鼠腹腔内注射0.1%的乌拉坦(5 mg/kg)水合氯醛麻醉大鼠,之后将大鼠左眼顶侧眶上皮肤切开，露出顶侧眶、眶壁和眶上缘切迹顶侧眶,切除眶上缘切迹两侧部分眶壁骨板(宽5 mm，深7-8 mm),将后部眼球筋膜剪开,沿上直肌向球后钝性分离,暴露眼球后视神经。在离后极部约3 mm，游离视神经约5 mm,用相当于98 g恒定压力的反向血管夹(型号：W40160，规格：3.7 cm；上海医疗器械厂(上海，中国) 钳夹同一部位的视神经5 s。术野用庆大霉素液冲洗5次后，以,青岛耐克医材有限公司(青岛，山东省，中国)生产的10-0号尼龙线分层缝合。造模后立即观察,对光反射消失,伤眼瞳孔散大，视网膜血管无出血或梗塞大鼠作为造模成功的动物纳入实验。

药物干预：对视神经损伤大鼠以人脐血干细胞(hUCBSC)干预组大鼠于造模7天后，用注射器向大鼠玻璃体内一次性注射hUCBSC106个[7]。对视神经损伤模型以脑源性神经营养因子(BDNF)干预组大鼠于造模7天后[7]，用注射器向大鼠玻璃体内一次性注射BDNF50 ng。

各组大鼠视觉电生理检测：各组大鼠于造模后即刻和造模30d后以REFZ-POZE21sompace型视觉电生理仪(德国、慕尼黑)检测各组大鼠的闪光视觉诱发电位(F-VEP)指标，参考电极置于额部正中，记录电极放于枕骨结节上1.5-2.0 cm处，将参考皮肤电极放置在眼眶颞侧，将接地电极放置在耳垂；将角膜接触镜电极放好，电极放好后开始刺激，闪光照度2 挡，60lx，频率2Hz，分析时间250 ms。

各组大鼠视觉电生理检测完成后，以耳缘静脉注气法处死各组大鼠，使视神经暴露，在苏州六六科技股份有限公司(苏州，江苏省，中国)生产的YZ6F直接检眼镜下以手术刀切取大鼠眶内段同一部位视神经，放在装有生理盐水的容器内，存放于4℃冰箱内。

大鼠视神经试样应力松弛实验： 以CCs-3型读数显微镜(长春市第三光学仪器厂)测量视神经试样的几何尺寸，试样长度为10 ±0.1 mm，视神经损伤模型以hUCBSC干预组试样直径0.79-0.82 mm、正常对照组试样直径0.78-0.82 mm，视神经损伤模型组试样直径0.76-0.81 mm、 视神经损伤模型以BDNF干预组试样直径00.780-81 mm mm。按参考文献[8]的方法分别对每个试样进行预调处理后待用。应力松弛实验温度设定为36.5±1.0℃，将试样装夹在MODEL55100型电子万能试验机(长春试验机研究所生产)的夹具内，以60%/min的速度对试样进行应力松弛实验，当各组大鼠视神经试样应力为0.386 Mpa，视神经损伤模型组试样应变为2.86%、正常对照组试样应变为3.14%、视神经损伤模型以BDNF干预组试样应变为2.94%、视神经损伤模型以hUCBSC干预组试样应变为3.06%时保持应变恒定，应力松弛实验时间为7 200 s。达到7 200 s时，计算机自动输出应力松弛实验结果。实验中不断的向试样淋生理盐水，以使试样保持湿度。

统计学分析方法：以美国SPSS16.0 软件包(SPSS,Chicago,IL,USA)对视神经试样应力松弛实验数据进行分析，计量资料以mean±SD表示，采用Sceffe法和单因素方差分析法比较组间数据差异，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 各组大鼠闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测结果

各组大鼠视神经闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测结果见表1。

表1 各组大鼠视神经闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测结果(n=20)

注:造模30天后各组比较：与模型组比较aP<0.05,与hUCBSC干预组比较，bP<0.05。

F- VEP 记录 图形分析标准: P1 波幅值为自N1 波谷底至P1 波峰顶,潜伏期为自触发时至P1峰为止。

2.2 以计算机拟合的视神经试样应力松弛实验曲线

以计算机拟合的视神经试样应力松弛实验曲线见图1.

图1 以计算机拟合的大鼠视神经应力松弛实验曲线

视神经应力松弛实验结果显示，BDNF干预组hUCBSC干预组大鼠视神经的7 200 s应力下降量大于模型组大鼠视神经的7 200 s应力下降量(P<0.05)，以hUCBSC干预组大鼠视神经的7 200 s应力下降量大于以BDNF干预组鼠视神经的7 200 s应力下降量(P<0.05)，各组大鼠视神经试样的应力松弛曲线的函数表达关系均是以对数关系变化的。

3 讨论

通过电生理检测判断视神经损伤恢复效果是一种重要的检测方法。各组大鼠视神经电生理检测结果表明，模型组大鼠视神经峰值电压小于视神经损伤动物模型以BDNF干预治疗组和以hUCBSC干预治疗组(P<0.05)，模型组大鼠峰潜时值大于视神经损伤动物模型以BDNF干预治疗组和以hUCBSC干预治疗组(P<0.05)，视神经损伤动物模型以BDNF干预治疗组Pl峰值电压小于视神经损伤动物模型以hUCBSC干预治疗组(P<0.05)。

各组大鼠视神经应力松弛实验结果显示，视神经损伤动物模型以BDNF干预组和以hUCBSC干预组大鼠视神经的7200s应力下降量大于视神经损伤动物模型组(P<0.05)，视神经损伤动物模型以BDNF干预组7200s应力下降量小于以hUCBSC干预组 (P<0.05)，各组大鼠视神经试样的应力松弛曲线均以对数函数关系变化，视神经损伤后改变了视神经的应力松弛特性。

大鼠视神经电生理、应力松弛检测结果证明，视神经损伤模型大鼠以BDNF、hUCBSC干预治疗后，对视神经损伤模型大鼠电生理指标、应力松弛特性指标具有恢复的作用，说明视神经损伤模型大鼠通过以BDNF神经营养因子、人脐血干细胞(hUCBSC)干预治疗，具有一定的疗效，以hUCBSC的干预治疗神经损伤模型大鼠的效果更好。

视神经为粘弹性生物材料，粘弹性生物材料的粘弹性的表现形式主要为蠕变和应力松弛，视神经的应力松弛特性是视神经承受应变适应性的反应。视神经的应力松弛特性是为了适应其生理功能需要而存在的，视神经正常范围的应力松弛力学特性有利于抵抗恒变形对视神经的伤害，完整结构的视神经应力松弛特性有利于视神经的生理功能需。分析认为，大鼠视神经损伤后，纤维结构紊乱、排列发生了改变，对应力松弛特性产生了影响。视神经损伤通过以hUCBS、BDNF干预治疗后视神经的应力松弛特性得到了一定的恢复。

Chen等[10]对视神经损伤动物模型的研究发现，在动物玻璃体腔内注入BDNF，1周后视网膜存活的RGCs比例增高，得出了视神经损伤动物模型以BDNF干预治疗有一定的效果，RGCs具有保护轴突作用的结论。大量的研究结果表明，外源性供给BDNF及GDNF可很好的改善节细胞的存活率,促进节细胞轴突再生[11]。本实验结果支持参考文献[11]视神经损伤模型动物通过BDNF干预治疗可改善视神经节细胞的存活率,促进节细胞轴突再生的观点，

脐血作为干细胞的重要来源，广泛的应用于修复神经损伤的临床及基础研究中，脐血间充质干细胞对神经损伤修复的机制尚未完全搞清楚，分析认为，其作用机理系由于在局部微环境的刺激下，干细胞通过自分泌的形式产生各种细胞因子向受损组织分化并替代受损细胞，与周围细胞建立联系促进神经功能的恢复[12-14]。

以往以药物干预治疗视神经损伤动物的效果以电生理测试、观察组织形态等研究居多[1]。本实验与以往研究的区别是，对比分析了对视神经损伤模型大鼠、视神经损伤模型大鼠以BNTF、以hUCBSC干预治疗后视神经的应力松弛特性，以归一化分析的方法的方法处理各组大鼠视神经的应力松弛实验数据，得出了各组大鼠视神经的归一化应力松弛函数方程，建立大鼠视神经的归一化应力松弛函数方程，能定量的阐明大鼠视神经的应力松弛力学特性。本文的创新性是以视神经的应力松弛特性等研判视神经损伤模型以BNTF、以hUCBSC干预视神经损伤的效果。

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吉林省科技发展计划资助项目(20110492)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0901-04

2016-12-24)