三维打印双相磷酸钙陶瓷支架在骨组织工程中的应用

李佳乐，夏轶超，澈力格尔，刘 敏，王梓霖， 韩 冰*

(1.吉林大学口腔医院 口腔颌面外科，吉林 长春130021；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室)

三维打印双相磷酸钙陶瓷支架在骨组织工程中的应用

李佳乐1，2，夏轶超1，澈力格尔1，刘 敏1，王梓霖1， 韩 冰1*

(1.吉林大学口腔医院 口腔颌面外科，吉林 长春130021；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室)

目的 探索研究三维打印技术制备的由羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/β-TCP)组成的双相磷酸钙陶瓷(BCP)支架在骨组织工程中的应用潜力，为其作为骨组织工程支架提供试验基础。方法 通过三维打印技术制备质量比为3∶7的HA/β-TCP复合纳米支架，扫描电镜(SEM)观察支架形态。将支架与兔骨髓间充质干细胞共培养；通过CCK-8实验检测支架的生物相容性以及种子细胞在支架上的增殖分；并以相同材料制备的压模片进行比较。结果 三维打印技术制备的双相磷酸钙陶瓷支架为三维均匀多孔隙结构，骨髓基质干细胞能够在此支架上很好的增殖，分化。结论 三维打印制备双相磷酸钙陶瓷支架有较好的相容性，可促进细胞的分化，可作为细胞支架应用于骨组织工程中。

三维打印技术； 纳米羟基磷灰石； β-磷酸三钙 ；骨髓间充质干细胞； 骨组织工程

(ChinJLabDiagn,2017,21:0878)

因先天畸形、自然灾害及交通事故所致外伤、肿瘤及感染等各种因素引起的骨缺损在临床上十分常见。这些骨缺损不同程度地影响着患者缺损部位的形态与功能，常常给患者带来极大的不便[1]。传统的治疗方法都有着各自的局限性。如自体骨移植于供骨区的二次损伤，来源有限；同种异体骨移植虽经过处理，但易引起免疫反应，易吸收易感染等；人工骨材料如金属等在力学性能及生物学性能上与骨组织存在显著的差异等[2,3]。由于现行骨缺损修复方法存在以上问题，骨组织工程修复骨缺损受到了越来越多的重视，已成为临床医学及生物学研究的重点。

组织工程包括支架，种子细胞，生长因子这三个关键因素。其中，骨支架的性能常常影响组织工程的成败。理想的骨支架材料应具有良好的生物相容性，生物力学性，生物降解性。同时又应具有较高的可塑性，且易于加工，来源充足等优点[4,5]。

双相磷酸钙(Biphasic calcium phosphate,BCP)，由羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)组成。其化学成分与骨组织的无机成分相似，目前已被广泛应用于组织工程支架的研究中，对于骨缺损的修复和重建中有着重要的研究价值。

支架的制备方法大致分为相分离法，气体发泡法，熔盐法，微球法等传统制备方法。然而，这些传统方法都不能精确的控制其孔隙。三维打印技术是根据预先设计的模型，通过逐层沉积以完成整个支架的制备，可以精确地完成形状以及孔隙的要求[6]。

本实验使用双相磷酸钙陶瓷作为支架材料，利用三维打印技术，制备质量比为HA/β-TCP：30/70的准确控制孔隙大小结构的三维双相磷酸钙陶瓷支架，研究微观支架结构，及骨髓间充质干细胞在支架上的增殖，探讨其应用于骨组织工程的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 普通级健康新西兰大白兔，2周龄，体重约300 g，雌雄不限，由吉林大学动物实验中心提供。

1.1.2 试剂和材料 L-DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；CCK-8(Sigma，美国)；HA、β-TCP、PVA(中科院上海市硅酸盐研究所)。

1.1.3 主要仪器 三维打印机(弗劳恩霍夫研究所，德国)；CO2恒温细胞培养箱(Sanyo，日本)；酶标仪(Bio-RAD，美国)；扫描电镜(SEM,SHIMADZU SSX-550，日本)。

1.2 方法

1.2.1 支架的制备 制备的支架为圆柱状，高3 mm，直径3 mm。孔隙为正方形，孔径为400 μm。在打印制备中，选择纳米 HA 和纳米 β-TCP粉末为原材料，以质量比为30∶70 的比例混合。以聚乙烯醇(poly vinyl alcohol ，PVA)为粘结剂。将上述 10 g 混合粉末与 5.6 g PVA 水溶液(质量比为6%)均匀混合配成可注射型的膏状物。喷射针头的压力控制在 200 到400KPa 之间，控制移动速度为 6 mm/s。根据预定模型数据控制喷射针头在三维方向的定向移动分层打印，直至整个支架打印完成。初模型在室温下干燥过夜，第二天在1 100℃烧结3 h，BCP 支架最终成型[7]。同期制备BCP压模片材料作为对照。将上述混合好的粉末放置于模具中，用5 Mpa的压缩强度制成与三维打印支架材料直径及高度相同的圆柱形，同样于1 100℃烧结3 h，制备成型。

1.2.2 SEM表面形态观察 干燥后的支架表面喷金，对其表面进行扫描电子显微镜(SEM)观察。

1.2.3 兔骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离培养 兔处死脱毛处理后，置入75%的酒精中消毒，移至超净台内，无菌条件下解剖分离出双下肢骨，剪去骨一端，用内含配置好的培养基的注射器抽取骨髓腔内骨髓。后将抽取的骨髓-培养液注射入培养瓶中。于37℃孵箱中静置培养。静置72 h后行第一次半换液。后常规培养传代。传至第三代时即为需要的骨髓间充质干细胞[8]。

1.2.4 CCK-8实验检测细胞增殖活性 将组织培养板表面(tissue culture plate surface,TCPS)作为空白组。即分为三组：实验组，对照组，空白组。每组设置6个重复。支架及压片经去离子水超声振荡清洗，烘干，高压蒸汽灭菌后放入96孔培养板中，每孔放置 1 件材料。取上述细胞，制备细胞悬液，每孔(材料表面和孔板底)接种细胞数量为2×103个，常规培养。分别于1 d、3 d、5 d、7 d后终止培养。在超净台中每孔加入CCK-8溶液10 μL后孵育，37℃，2 h。每孔吸取孔内溶液，按照原来的顺序加入到新的96孔板中，450 nm波长测量各组溶液吸光度值A。按照下述公式计算细胞增殖活性：Cell viability(%)= A sample / A control ×100(其中A control 代表对照组的吸光度值，A sample 代表实验组的吸光度值。)

1.2.5 统计学分析 使用SPSS22.0统计软件包对数据进行多因素方差分析及T检验。P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 支架的宏观结构 如图1，采用三维打印技术制备的支架呈圆柱型，支架孔隙大小均匀，孔隙互相连通(图1A)；压制模片(图1B)质地均匀，表面光滑。

图1 制备的双相磷酸钙陶瓷支架，1A所示为三维打印的三维多孔支架，1B为利用模具压缩成型的模片

2.2 SEM观察 支架表面结构的扫描电镜见图2。可以看出三维打印制备的支架孔隙控制的十分均匀，大小一致，孔隙之间相互连接。空隙大小在350-450 μm之间。空隙壁粗糙不平，有许多可达微米级别的微孔。

图2 三维打印 BCP 支架的扫描电镜，BCP 支架表面的微观结构(2a,2b)，孔隙壁表面的微观结构(2c，2d)

2.3 CCK-8实验结果 BMSC与支架共培养1,3,5,7 d 后各组支架表面粘附细胞吸光度值结果见图3。可见，各组的吸光度值随培养时间逐渐增大，说明细胞数量随时间增加稳定增长。结果表明，骨髓间充质干细胞在支架上可以稳定生长。在体外培养 1 d，3d，5 d，空白组的细胞数量明显高于实验组及对照组组(P<0.05)。在1 d时，可见对照组细胞数量高于实验组(P<0.05)，而在第3 d，5 d 时，对照组与实验组细胞数量无明显差异(P>0.05)。培养7 d 后，对照组的细胞数量低于实验组及空白组(P<0.05)。

3 讨论

本实验制备的BCP支架中的HA和β-TCP是目前使用较多的已被验证性能较好的支架材料。β -TCP的成分与骨矿物组成相似，生物相容性好，被植入体内后逐渐降解，最终无异物残留，这使得材降解后所形成的新骨不受影响；而且新骨强度优于新骨-材料结合的强度；但疲劳强度低，脆性大，力学性能一般，降解快[9]。HA的化学组成及晶体结构与人骨骼中的磷灰石相类似，形态稳定，力学性能良好，是公认的性能良好的骨修复材料，但其降解速率缓慢[10]。通过调控两种材料的混合比例，使得材料的降解率变的可调控，可满足组织工程的降解要求。

*P<0.05、**P< 0.01。

这也是我们将HA与β -TCP的比例定为3∶7的原因之一。一方面，HA的低降解率和较好的力学性能可以缓和因β -TCP的快速降解而降低的支架结构的稳定与强度，使得支架在降解，细胞的增殖分化，新骨在形成的过程中仍有支架的“框架支撑”。另一方面，β -TCP在BCP中优先于HA降解，产生较多的游离钙、磷离子，“创造”其周围的过饱和状态，矿化物质地沉积从而引导新骨形成，并吸引周围的骨形成蛋白(BMPs)，诱导间充质干细胞向成软骨细胞或成骨细胞方向分化，促进成骨[11]。然而，过多的游离的钙磷离子会引起炎症反应，使创口延期愈合，从而影响新骨形成[12]。 所以我们最终将两种材料的比例设置为3∶7。

对于细胞的生长来说，100-500 μm孔隙率对于非常有利于细胞长入[13],而据报道，如果孔径大于300 μm，十分有利于血管化和骨再生[14]。在另一方面，如果孔径较大，支架的力学性能将会大打折扣。最后，本实验设计制备的孔隙大小定为400 μm。从SEM图像可以很明显的看出，通过三维打印技术制备的BCP支架有着350-450 μm大小的孔隙，且孔隙大小、分布均匀并互相连通，对细胞粘附增殖有良好促进作用[15]。此外，镜下可观察到支架表面有很多微孔(图 2.c,d)，这些微孔增加了材料的表面积，也增加了细胞在材料的表面粘附和增殖的空间。

CCK-8结果表示，在细胞培养1天和3天之后，实验的细胞增殖比空白和对照组低。且空白组较其他两组一直表现出较高的细胞数量。这似乎与我们的预期相矛盾。这可能是制备的细胞悬液在滴入支架进行细胞接种时，有些细胞会通过支架的孔隙落入到孔板底部，未能成功种植于支架表面。这使得支架比其他两组有更低的原始细胞的数量。在体外培养5天后，实验组的细胞数量已与对照组相接近，7天后就表现为高于对照组。这说明，BCP支架显示更优良的的生物相容性。此外，在四个检测时间点，与其他两组相比，空白组的细胞数量一直表现较高水平。这可能是培养孔板底经过处理有着亲水性能较好的表面而能促进细胞的粘附，使得细胞更容易种植[16]。同时干细胞处于分化状态时其增殖水平会减低甚至是停止，这也使得有支架材料的细胞数量较空白组表现“稍低水平”。培养后期，BCP支架与具有二维平面结构的模片和空白对照组相比有着更大的表面积。由于细胞在限定空间内增殖发生的接触抑制，BCP支架表现出了更高的细胞增殖率，细胞数量也与孔板表现没有明显差距。

综上所述，利用三维打印技术制备的多孔双相磷酸钙陶瓷骨支架具有良好的生物相容性，其互通完善、交通良好的均匀孔隙以方形的形式存在，表面粗糙的微孔形态也使得这种三维孔隙结构有利于细胞粘附、增殖。本实验初步验证了BCP支架在骨组织工程中应用潜力，为后续实验及其临床应用提供了基础。

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The application of Biphasic calcium phosphates ceramic scaffold by 3D printing in bone tissue engineering

LIJia-le,XIAYi-chao,CHELigeer,etal.

(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolandHospitalofStomatology,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To evaluated the biphasic calcium phosphates ceramic scaffold by 3D printing,which is consists of hydroxyapatite and β-tricalcium phosphate (HA/β-TCP),and provide the experimental basis used for bone tissue engineering.Methods 3D printing technology was applied to prepare porous BCP scaffolds，and BCP cylinder was were prepared by mold materials.The composition ratio of BCP (%HA/%β -TCP) was 30/70.Scaffold was observed by scanning electron microscopy (SEM) .Rabbit bone mesenchymal stem cells were seeded on the scaffolds and cultured together.Results Scaffold-BMSCs were investigated with regard to cellular,spreading and proliferation through analyses of CCK-8.Conclusion The BCP scaffold had a good biocompatibility and may be a promising material in bone tissue engineering.

3D printing technologies;Nano-hydroxyapatite;β-tricalcium phosphate;bone mesenchymal stem cells;bone tissue engineering

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉科教合字[2015]第525号)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0878-04

R783.1

A

2016-10-11)