血红素氧合酶-1在七氟醚后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

李 翔 ，范志强，王建刚，田首元，金弋乔，杨 春，段 俊

· 基础医学论著/研究·

血红素氧合酶-1在七氟醚后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

李 翔1，范志强2，王建刚3，田首元3，金弋乔1，杨 春1，段 俊2

目的 研究七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，探讨血红素氧合酶-1(HO-1)的发挥作用。方法 健康雄性SD大鼠30只，体重230 g ～260 g，采用随机数字标示法分为5组，每组6只。假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、七氟醚后处理组(SP组)、七氟醚后处理加用锌原卟啉(ZnPP)组(SP+Zn组)、锌原卟啉组(Zn组)。S组丝线穿过冠状动脉前降支(LAD)不结扎，I/R组、SP组、SP+Zn组、Zn组结扎30 min后松开结扎线并再灌注120 min。I/R组、Zn组再灌注前3 min分别单次股静脉注射生理盐水1 mL，Znpp(5 μg/kg)稀释液1 mL并吸入纯氧3 min；SP组、SP+Zn组再灌注前3 min分别单次注射生理盐水1 mL，ZnPP(5 μg/Kg)稀释液1 mL并吸入2%七氟醚3 min。再灌注满120 min后，①取抽取动脉血用酶联免疫吸附法(ELISA)测血清肌钙蛋白(cTn-I)含量。②取心尖缺血组织测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。③用蛋白印迹法(Western-blot)测心尖缺血组织中HO-1含量。结果 与S组相比，其余各组cTn-I、HO-1、MDA含量均明显升高，SOD活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，SP组cTn-I、MDA含量明显下降，HO-1含量、SOD活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R组、SP+Zn组、Zn组两两比较cTn-I、HO-1、MDA含量和SOD活性，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HO-1在七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护机制中起关键作用。

心肌缺血再灌注损伤；七氟醚；缺血后处理；血红素氧合酶-1

心肌缺血再灌注损伤(myocardium ischemic reperfusion injury，MIRI)防治的研究一直是医学热点。七氟醚是新型吸入麻醉药，具有诱导迅速及苏醒快而完全，血流动力学稳定，广泛用于临床麻醉。已证实，七氟醚对MIRI预处理和后处理均对心肌缺血再灌注损伤有保护作用[1-4]。而七氟醚后处理因为操作更加安全、简便，避免了缺血后处理要求短暂反复缺血-再灌注的潜在风险和医学伦理道德的限制，更具有可行性，也更适合临床应用[5]。

人类细胞经过进化，具有多种抗氧化应激的保护机制，其中血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)就是重要的保护机制之一，HO-1能将前氧化物血红素降解为一氧化碳(CO)、胆绿素(会进一步被降解为胆红素)和二价铁[6]。通过降解前氧化物血红素而产生抗氧化物胆红素，HO-1 可以保护细胞免受氧化损伤。但七氟醚后处理对心肌的保护是否通过HO-1的表达发挥作用，目前研究尚罕见，值得进一步探讨。故本课题拟通过建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨七氟醚后处理是否能通过影响心肌细胞HO-1表达，从而发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康雄性SD大鼠30只，体重230 g～260 g，许可证编号[SCXK-20140013]，采用随机数字标示法分为5组，每组6只。假手术组(S组)、心肌缺血再灌注损伤组(I/R组)、七氟醚后处理组(SP组)、七氟醚后处理+ZnPP组(SP+Zn组)及ZnPP组(Zn组)。

1.2 动物造模 实验前12 h禁食，腹腔注射20%乌拉坦5 mL/kg麻醉下，仰卧位固定于恒温动物解剖台上，针状电极插入左前肢、右前肢和右后肢皮下，连续监测Ⅱ导联心电图。颈部正中切开，气管插管后连接动物呼吸机行机械通气，潮气量(2～4) mL/kg，通气频率(70～80)次/min，吸呼比维持在1∶3。左侧第4肋间开胸，剪开心包，暴露心脏，于左冠状动脉前降支(LAD)起始部下2 mm处放置6/0丝线备用。稳定10 min，待心脏恢复规律性跳动时，结扎LAD，以心电图Ⅱ导联ST段抬高0.1 mV或T波高耸，心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志。结扎30 min后松开结扎线，再灌注120 min，以缺血区心肌变红，抬高的ST段或T波回落为再灌注成功的标志。S组：丝线穿过LAD但不结扎；I/R组：结扎LAD30 min，再灌注120 min，在再灌注前3 min单次注射生理盐水1 mL，吸入纯氧3 min。SP组：在再灌注前3 min单次注射生理盐水1 mL，吸入2%七氟醚3 min，余同I/R组；SP+Zn组：操作同七氟醚后处理组，但在给予七氟醚前，静脉注射 HO-1 抑制剂锌原卟啉(ZnPP)(5 μg/kg)稀释液1 mL；Zn组：在缺血心肌再灌注前3 min静脉注射ZnPP(5 μg/kg)稀释液1 mL，吸入纯氧3 min。实验期间，盐水纱布覆盖切口，保证大鼠肛温保持在(36.5～37.5)℃。

1.3 血浆肌钙蛋白(cTn-I)的测定 再灌注120 min 时，经腹主动脉采血2 mL于真空促凝管，静置10 min后4 000 r/min离心10 min，取上层清液，用大鼠cTn-I酶联免疫吸试验(ELISA)试剂盒(BioSwamp)检测。

1.4 心肌组织HO-1的表达 切取约300 mg的心尖缺血心肌置于-80 ℃冰箱保存。将心肌组织称质量、剪碎、加裂解液(1∶10)，14 000 r/min离心5 min后取上层清液用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。根据蛋白定量结果加入蛋白样品和上样缓冲液，用电转仪将凝胶上分离到的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%BCA封闭2 h，用兔抗鼠HO-1抗体(稀释度1∶25 000，ABCAM公司)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(稀释度1∶550，武汉博士德生物工程有限公司)4 ℃孵育过夜，次日用过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(稀释度1∶3 500，武汉博士德生物工程有限公司)孵育2 h，洗膜后用电化学发光(ECL)发光液显影。采用凝胶成像系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值和GAPDH条带灰度值的比值反映HO-1的表达。

1.5 心肌组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量测定 再灌注120 min后，处死大鼠，取结扎点以下缺血区心肌组织，加预冷0.9%氯化钠溶液制成10%组织匀浆。黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量；硫代巴比妥酸显色测定脂质过氧化终产物MDA含量。

2 结 果

2.1 血清 cTn-I含量的比较 与S组比较，其余各组血清cTn-I含量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R 组比较，SP 组 cTn-I 含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R组、SP+Zn组及Zn组组间cTn-I含量差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.2 心肌组织HO-1蛋白的比较 各组心肌HO-1的表达，差异无统计学意义(P>0.05)。与S组比较，其余各组心肌HO-1表达明显上调(P<0.05)；与I/R 组比较，SP组心肌HO-1表达明显上调(P<0.05)；I/R组、SP+Zn组及Zn组间HO-1表达，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.3 心肌组织SOD活性、MDA含量比较 与S组比较，其余各组心肌组织SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，SP组心肌组织SOD活性明显升高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R组与SP+Zn组、Zn组比较，心肌组织SOD活性和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌组织cTn-I、HO-1、MDA含量和SOD活性比较(±s)

3 讨 论

本实验参考文献[7]确定了七氟醚的给药浓度、方式，建立模型稳定。在对结果的分析当中发现，相比较于I/R组，SP组的SOD活性明显升高，MDA含量明显下降，cTn-I含量也明显降低。提示经过七氟醚后处理的心肌缺血大鼠在再灌注后心肌损伤程度有明显减轻。在对七氟醚后处理的MIRI保护机制的研究中，被最早观察到的是丝裂原活化激酶p42和p44的激活和NO的生成[8]，之后磷脂酞肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3k-AKT)[9]、钠巴霉素的哺乳动物靶子/70KD核糖体蛋白s6激酶和一氧化氮合成酶也被发现起到了一定作用[10-11]。MIRI损伤程度可通过心肌组织氧化损伤程度反映，而SOD活性和MDA含量的检测能够有效反映组织氧化损伤程度[12]。SOD是一种源于有机体、能够清除氧自由基的特异性酶，也是在生物体内清除氧自由基的首要物质。因此SOD活性可直接反映机体对氧自由基的清除和抗氧化能力。MDA是细胞膜上不饱和脂肪酸受到氧自由基攻击后的标志物，其含量变化也可反映机体组织过氧化损伤程度。

本次实验在建造模型时还引入HO-1抑制剂ZnPP，在结果中发现加入ZnPP的SP+Zn组和Zn组的血清cTn-I含量、组织MDA含量都较SP组升高，SOD活性有明显下降，与I/R组比较差异无统计学意义。另外在通过对HO-1蛋白含量的检测中发现，SP+Zn及Zn两组的HO-1蛋白含量也比SP组明显降低，与I/R组差别不大。提示了七氟醚对MIRI后处理的保护机制主要是通过诱导HO-1蛋白表达来完成的。血红素氧合酶(HO)在机体内有三种同工酶：HO-1、HO-2、HO-3。其中HO-1是可诱导型，是一种氧化应激诱导的基因产物，也是热休克蛋白家族中的一个成员，又称HSP-32。前文已述，HO-1可通过将血红素降解为胆绿素、二价铁离子和CO发挥对组织的抗氧化损伤作用。其中，胆绿素可进一步还原为胆红素，二者可以发挥清除氧自由基和脂质过氧化物酶的作用[13]。二价铁离子则可以通过调节铁蛋白的方式达到清除氧自由基的目的[14]。虽然NO、一氧化氮合成酶均可对MIRI有保护作用，但是NO的保护作用却是两面性的，NO在低浓度时有扩张冠脉、降低再灌注中性粒细胞激活的作用，而高浓度的NO却对心肌组织有负性肌力作用，并可与氧迅速反应生成大量氧自由基加重损伤[15]。而HO-1催化生成的CO具有反馈性抑制NO大量合成的作用，从而减轻组织的损伤[14]。

综上所述，七氟醚后处理作为一种更安全、简便且更贴近临床的方式，对MIRI有明显保护作用，并且通过HO-1的表达发挥作用。但HO-1的表达升高是被七氟醚通过什么机制所诱导还有待进一步研究。

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(本文编辑王雅洁)

山西省自然科学基金面上项目(No.2014011040-9)

1.山西医科大学(太原 030001)；2.山西博爱医院；3.山西医科大学第一附属医院

通讯单位：范志强， E-mail：fankm@163.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.09.009

1672-1349(2017)09-1048-03

2017-02-21)

引用信息：李翔 ，范志强，王建刚,等.血红素氧合酶-1在七氟醚后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(9)：1048-1050.