黄曲霉毒素检测系统的设计与实现*

陆勤佳,蔡 强*,沈国金,王振华

(1.杭州电子科技大学电子信息学院,杭州 310018;2.浙江清华长三角研究院,浙江 嘉兴 314006)

黄曲霉毒素检测系统的设计与实现*

陆勤佳1,2,蔡 强1,2*,沈国金2,王振华2

(1.杭州电子科技大学电子信息学院,杭州 310018;2.浙江清华长三角研究院,浙江 嘉兴 314006)

基于高效液相色谱荧光法设计并完成了一套黄曲霉毒素检测系统。该系统主要由分离系统、恒温控制系统、荧光检测器、主控板和人机交互界面组成。仪器通过分离系统将黄曲霉毒素进行分离,再由荧光检测器激发黄曲霉毒素产生荧光,以光子计数的方式进行信号采集,最终在PC的色谱工作站上显示检测结果。经测试表明该系统具有良好的稳定性,结构紧凑,检测速度快,灵敏度高,能用于黄曲霉毒素的实际检测。

高效液相色谱荧光法;黄曲霉毒素检测;荧光检测器;光子计数

黄曲霉毒素AFT(Aflatoxin)是由真菌类如黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的一类有毒的次级代谢产物,主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2[1]。它们在自然界中广泛存在,且具有强致癌性[2-3]。黄曲霉毒素已成为食品质检的必检项目之一[4]。

黄曲霉毒素的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法[5-6]、也有一些酶联免疫吸附法[7]、检测卡等快检方法。国标检测法灵敏度高、重现性好,可同时检测多个黄曲霉种类。但是检测周期长,操作复杂,且一般检测仪器庞大,不能满足简捷、现场化的要求。而免疫检测法虽然检测速度快、操作简单,但是检测准确度和精确度都比较差。

本文以高效液相色谱法为基础,开发特定波长荧光检测模块,将液相色谱和荧光检测集成于仪器,研制专用黄曲霉毒素检测系统,力图解决传统国标检测仪器体积庞大、操作复杂的问题。

1 系统结构和检测原理

图1和图2分别为黄曲霉毒素检测系统的结构图和实物图。该系统主要由分离系统、恒温控制系统、荧光检测器、主控板和人机交互界面组成。

检测原理:仪器上电后输液泵工作加压,待测AFT样品(经提取、净化处理后所得样品)通过进样阀加入,随流动相进入柱温箱内的C18色谱柱中[8]。各AFT在亲和色谱作用下被分离,依次进入检测器内置的玻盒中。在LED的激发下各AFT产生光强不等的荧光信号。这些荧光信号经过透镜、滤光片等光路作用被PMT接收,由计数模块进行光子计数[9]并上传给上位机,最终上位机通过谱图处理得到各AFT的浓度。

图1 黄曲霉毒素检测系统结构图

图2 黄曲霉毒素检测系统实物图

2 主要硬件模块

2.1 分离系统

分离系统主要由输液泵和C18色谱柱组成。其中输液泵采用清博华科技的一款型号为P1010的产品。色谱柱采用了赛智的一款型号为Vertex-C18色谱柱。

2.2 恒温控制系统

温度会影响C18色谱柱对AFT的分离效果。为了保证检测结果的准确性,设计了恒温控制系统,将色谱柱温度控制在25°C(±1°C)。图3为恒温控制系统实物图。它由柱温箱、制冷热片、风扇、DS18B20温度传感器以及温控板组成。柱温箱为一个柱状封闭的铝合金箱体,用于放置C18色谱柱。在柱温箱(距两侧20 cm)下壁紧贴着两个半导体制冷热片,制冷热片的下方是两个用于辅助散热的风扇。在箱体的两侧装有两个防水型DS18B20数字温度传感器[10],用于实时监测箱内色谱柱的温度[11]。温控板通过读取传感器温度与目标设定值进行比对,控制制冷热片加热或制冷。

图3 恒温控制系统实物图

2.3 荧光检测器

为保证耦合效率,荧光检测器采用紧凑结构,整个检测器由光源模块和信号采集模块组成。其中光源模块包括LED驱动电路和光路结构。信号采集模块包括PMT和CPLD计数电路。图4和图5分别为荧光检测器原理图和实物图。检测器采用LED(索雷博,LED370E)作为光源,单色光经透镜准直后垂直入射石英玻盒。此时流经玻盒的流动相中若混有被分离的AFT,在LED紫外光(365 nm)的激发下就会产生荧光,荧光信号经透镜聚光准直、滤光片(440 nm)滤除杂散光后被PMT检测窗口接收。PMT将光信号转换为电脉冲信号,最终被CPLD计数电路采集以光子数的形式反映荧光信号强弱。

图4 荧光检器检测原理图

图5 荧光检测器实物图

为保证LED光功率的稳定,系统采用闭环控制方式给LED供电。图6为光强反馈驱动电路。采用ADI公司的ADN2830集成芯片,芯片偏置电流输出范围在4 mA～200 mA,支持可编程报警机制,可软件控制光源驱动器。其中PSET引脚为光功率设置引脚,可接光电池来监测LED的光功率,IBIAS引脚为偏置电流输出引脚,接LED。芯片通过光电池反馈光强从而调节IBIAS引脚输出电流的大小,采用闭环控制方式保证了LED光功率的恒定。光功率的大小可以通过改变R3的阻值来调节(本电路中选用24 kΩ)。

图6 光强反馈驱动电路

检测器模块的PMT采用日本滨松公司的H10682-210光子计数探头,该探头包含了一个金属封装型光电倍增管,高速光子计数电路和高压电源。它的计数灵敏度(400 nm)可以达到6.1×105s-1·pW-1,典型暗计数为50 s-1,计数线性为5.0×106s-1,脉冲对分辨率为20 ns。其输出信号为电脉冲信号,直接由CPLD计数电路采集。

激发的荧光信号强度与AFT的浓度呈正相关关系,为保证高浓度时计数不溢出,计数模块必须要有宽范围的线性计数范围。以20 MHz频率为计数上限,一般的单片机难以达到要求,本系统采用Altera公司的EPM240T100C5N芯片作为计数模块的主芯片。该芯片的最大工作频率可达304 MHz,采用该公司开发的QUATUUS Ⅱ软件,使用Verilog语言来进行软件开发。

2.4 主控板

主控板实现数据的传输和控制。采用ST公司的STM32F103RCT6单片机,它的最大工作时钟为72 MHz,拥有256K FLASH,48 K SRAM,5个串口,8个16位定时器,SPI通信[12]功能。主控制板主要功能如下:

(1)利用定时器精确定时0.1 s,通过SPI定时读取CPLD的计数值,并将计数值通过串口传给上位机。

(2)利用定时器精确定时2 s,通过串口定时查询泵的压力值,并将压力值通过串口传给液晶屏及上位机。

(3)利用定时器精确定时3 s,通过串口定时查询温控板的温度,并将温度通过串口传给液晶屏及上位机。

(4)通过读取IO电平控制PMT和LED的开关,通过串口发送指令控制泵的开关;接收进样阀的同步信号,控制计数的同步开始与停止。

(5)通过串口定时更新温度和压力值以及仪器的工作状态。

(6)通过串口接收上位机的下发指令,上传泵压力,柱温箱温度,计数值等数据;接收上位机的控制指令,控制泵、LED以及计数功能的开与关,设定泵的流量、柱温箱的温度。

2.5 电源模块

图7为仪器供电需求分析图。总电源为外接的220 V交流电,通过100 W的开关电源将交流220 V转换成直流24 V,再由DC/DC模块将直流24 V转为直流5 V。CPLD计数电路、主控板以及恒温控制系统的3.3 V直流电由SPX1117M3-3.3的稳压芯片由直流5 V转化而来。

图7 供电需求分析图

2.6 其他模块

RS232/485转网口模块采用了联创科技的一款型号为SL0110的产品,实现本地数据与以太网数据的交换[13]。液晶屏采用了谷鑫公司一款型号为MT32240A035的产品。该液晶屏分辨率为320像素×240像素,通信波特率为115 200,实时显示柱温箱的温度、输液泵的压力、泵和LED的开关状态以及整个仪器的工作状态。

3 通信协议

3.1 通信协议定义

除了CPLD计数电路与主控板之间采用SPI进行数据传输,主控板、恒温控制系统、分离系统以及上位机之间均采用串口进行数据传输。根据实际需求,设计表1通信协议帧。其中指令位分别为下发指令0x1010,查询指令0x1001,数据校验采用数据段按位异或方式。

表1 协议帧结构

*为具体指令编码

3.2 数据字段内容

整个数据协议帧共16 byte,其中数据字段的内容与长度如表2所示。

表2 协议帧数据段结构

图8 DS18B20温度采集流程图

4 系统软件设计

4.1 流程图

柱温箱的温度通过DS18B20定时采集,最终上传给液晶屏和上位机。图8是温度采集流程图。

主控板主要负责数据的传输与控制。柱温箱的温度、泵的压力以及CPLD计数值等均由主控板接收,最终将所有数据打包以RS232方式上传给液晶屏和上位机。图9是主控板工作流程图。

图9 主控板工作流程图

4.2 上位机软件

上位机包括采用C#开发的具有读写串口、曲线绘制功能的测试软件以及实际应用测试采用的清博华科技公司开发的色谱工作站。

5 性能测试

5.1 CPLD计数功能测试

CPLD计数电路的计数上限、计数误差以及计数稳定性对仪器的检测限、精度以及重复性均有很大影响,所以做了计数性能测试。

测试条件:采用Agilent公司81150A型号的信号发生器模拟光子经PMT转换后的电脉冲信号。输入占空比为50%、Vpp为2.5 V的矩形波信号,通过串口调试助手接收CPLD的计数值。

测试结果:实际最大计数值可以达到44 MHz,计数误差约为0.04%,最大计数波动值为38(44 MHz频率信号输入),满足实际设计需要。

5.2 黄曲霉毒素检测的应用测试

液相色谱条件:色谱柱:Vertex-C18色谱柱;流动相:V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=50∶35∶15;流速:1 mL/min;进样量:20 μL;柱温:25°C;LED激发中心波长:365 nm;荧光发射中心波长:440 nm。

测试试剂:如表2所示采用6种不同浓度的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准混合试剂进行测试,采用B1、G1浓度为2 μg/L,B2、G2浓度为0.005 μg/L标准混合试剂进行检出限测试。

表2 7种不同浓度的标准混合试剂

单位:μg/L

测试图谱:图10为B1、G1浓度为2 μg/L,B2、G2浓度为0.5 μg/L的标准混合试剂测试所得的谱图。图中从左到右分别为AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的4个标准峰。

图10 G2、G1、B2、B1标准混合试剂色谱图

测试结果:图11为AFB1的标准曲线图,由图10可以看出在0.25 μg/L～8.0 μg/L之间AFB1具有较好的线性关系[15]。G2、G1、B2、B1检测结果的线性关系如表3所示,检测精度、重复性和检出限如表4所示。由表3和表4可知仪器的线性度、检测精度以及重复性均较好。其中G1、B1的检出限可以达到0.1 μg/kg,这一数值低于欧盟限量标准(B1<2 μg/kg)[16]。

图11 AFTB1标准曲线图

AFT线性范围/(μg/L)线性方程相关系数G20.063～2.000y=3.1742x+1.8428≥0.9997G10.250～8.000y=0.7863x+0.2424≥0.9996B20.063～2.000y=4.9307x+1.5064≥0.9997B10.250～8.000y=1.5858x+0.5484≥0.9995

表4 4种AFT重复性和检出限

6 结论

设计并完成了一套紧凑型结构的黄曲霉毒素检测系统,采用不同浓度的AFT标准混合试剂进行测试。测试结果表明该仪器性能稳定,检测速度较快。4种AFT的r值均大于0.999 5,RSD均小于4%,说明仪器的线性度和精密度良好。G1、B1的检出限可以达到0.1 μg/kg,G2、B2的检出限可以达到0.005 μg/kg,能用于黄曲霉毒素的实际检测。

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Design and Implementation of Aflatoxin Rapid Detection System*

LUQinjia1,2,CAIQiang1,2*,SHENGuojin2,WANGZhenhua2

(1.Electronic Information Institution of HangzhouDianziUniversity,Hangzhou 310018,China;2.Yangtze Delta Region Institute of TsinghuaUniversity,Jiaxing Zhejiang 314006,China)

An integrated structure of aflatoxin detection system is designed and implements based on high-performance liquid chromatography with fluorescence method. This detection system consists of separation system,constant temperature control system,fluorescence detector,main control board and human-machine interface components. It separates aflatoxin by separation system and inspires aflatoxin producing fluorescence by the fluorescence detector. It uses photon counting method to collect the signal and finally through the PC of the chromatography workstation to display the detection results. Test results show that this system has good stability,compact structure,high detection speed and high sensitivity. It can be used for the actual detection of aflatoxin.

high performance liquid chromatography with fluorescence;aflatoxin detection;fluorescence detector;photon counting

项目来源:国家重大科学仪器设备开发专项项目(2012YQ15008705);浙江省科技计划项目(2015C33009);嘉兴市科技计划项目(2015AY11013)

2016-04-22 修改日期:2016-07-19

TP23

A

1005-9490(2017)03-0748-06

C:7210;7320T

10.3969/j.issn.1005-9490.2017.03.046