适用于橘子酒发酵的野生酵母初步筛选

陈清婵，孙爱红，简清梅，王劲松

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

适用于橘子酒发酵的野生酵母初步筛选

陈清婵，孙爱红，简清梅，王劲松

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

从橘子果肉中分离筛选出酵母菌4株，分别命名为JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4。4株酵母均具有典型圆形酵母属特征。经过对4株酵母的发酵力及所酿橘子酒的香气、色泽、风味等感官指标进行综合评价、比较。结果表明，菌株JZ-1发酵速度快，降糖彻底，产酒精能力强，酿造的橘子酒具有较好的橘子果酒的典型性，酒体色度好，为澄清透亮的黄色，酒液酒精度达到9.2%vol，残糖量为10.4 g/L。关键词：橘子酒；果酒酵母；筛选

CHEN Qingchan,SUN Aihong,JIAN Qingmei,WANG Jinsong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

橘子是一种较常见的水果，也是一种极佳的酿酒原料。它富含维生素C和柠檬酸，具有美容和消除疲劳的作用。以橘子为原料酿造的酒，酒精度低、营养价值高，也满足人们日益增长的养生需求[1]。因此，研制开发发酵型柑橘果酒不仅可大大提高柑橘的附加值，而且将成为极受欢迎的新型食品[2]。

由于葡萄酒的生产工艺已经成熟，好多果酒的研发都是参照葡萄酒，这使得研发的其他果酒口感不好、风味欠佳、果香不典型。所以没有商品化的橘子酿酒专用的酵母，是橘子酒生产和发展的一大阻碍。没有适宜的菌种，就酿制不出优质的果酒[3]。生产实践证明，菌种是果酒酿造的必要条件[4]，橘子酒的酿造也不例外。目前柑橘果酒的酵母多为延用葡萄酒酵母或果酒干酵母[5]。

目前有研究者从自然环境中分离柑橘酿酒酵母并对其进行鉴定[6]和特性研究[7-8]，也对非发酵酵母[9]和生香酵母进行了筛选[10]，比较不同酵母对柑橘果酒香气的影响[11]。本研究以荆门本地橘子为试材，从橘子果肉中分离酵母菌，通过对其发酵能力、产酒色度、产酒品质等性能的研究筛选出具有良好发酵性能的天然野生酵母，用于橘子酒的发酵。目的是为橘子酒的产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橘子：荆门当地市售；马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：青岛高科因海博生物技术有限公司；亚硫酸（分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂；蔗糖（分析纯）：郑州盛源化工产品有限公司；葡萄糖（分析纯）：吴江市恒达精细化工有限公司；2,6-二氯酚靛酚（分析纯）：杭州长青化工有限公司；抗坏血酸（分析纯）：武汉大华伟业医药化工有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）：湖北兴众诚科技有限公司；硫酸铜（分析纯）：广州市意强化工有限公司；亚铁氰化钾（分析纯）：广州市南福化工有限公司；氢氧化钠（分析纯）：安庆安通化工有限公司。

1.2 仪器与设备

DH-600型电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；ES-315高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TU-1901型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JJ-CJ-2FD型超净工作台：苏州金净科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘子酒工艺流程

橘子→去皮→压榨→制浆→调糖→发酵→澄清、过滤

橘子成熟后（无须过熟）去皮，榨汁，将果渣与果汁混合。于果浆中加亚硫酸调整二氧化硫质量浓度为60 mg/L，用蔗糖调整可溶性固形物含量为20.0%，分别将各菌株的培养液按5%的体积比例接入到200mL橘子汁中，摇匀后放入25℃培养箱中恒温发酵，发酵时间为7 d。发酵结束后过滤，弃滤渣，于滤汁中加入硅藻土0.7 g/L，低温澄清24 h，虹吸上清液，获得澄清橘子酒。

1.3.2 橘子酒酵母的分离、纯化及筛选

（1）橘子酒酵母的分离、纯化

分别从放置2 d的橘子果肉中取得菌悬液，在30℃、PDA培养基上平板培养3 d，观察菌落情况，然后对菌体进行镜检，分离出单个菌落，逐步进行分离、纯化[12]。取合适的菌体反复进行平板培养、分离、观察、镜检，将适宜菌株转移至试管斜面PDA培养基于30℃进行增殖培养，3 d后转移到4℃冰箱保藏备用[13]。

（2）菌落形态学鉴定

参照《真菌鉴定手册》[14]和《酵母菌的特征与鉴定手册》[15]，对酵母进行形态学鉴定。

（3）菌种扩大培养

从斜面培养基上取一环活化菌种接入50 mL经灭菌处理的橘子清汁中，28℃摇床培养24h，振荡速度120 r/min[13]。

（4）酵母发酵力的测定

CO2失重法：取320 mL可溶性固形物含量为20.0%橘子汁于121℃高压灭菌30 min后，分别装到4个经灭菌处理的100 mL三角瓶中，每瓶80 mL，再分别接入2 mL各菌株扩大培养液，25℃培养7 d，测定其发酵液质量损失，并对各菌种发酵能力进行评价。

（5）菌株发酵速度的测定

分别向200 mL橘子汁发酵醪中添加2 mL[16]的各菌株扩大培养液，25℃恒温发酵7 d，通过定期测定发酵醪的含糖量变化，绘图比较各筛选菌株发酵速度的高低[17]。

（6）酵母对发酵酒液色度的影响

比色法：用TU-1910型紫外分光光度计，在波长520nm条件下用1 cm比色杯测各菌种发酵酒液的吸光度值，蒸馏水作为空白，比较各菌种对酒液色度的影响。

（7）酵母对酿造酒液感官评定的影响

表1 不同酵母酿造的橘子酒感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of orange wine fermented by different yeasts

将发酵好的橘子酒给10位师生进行感官评定，结合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]，制定感官评分标准见表1，满分100分。取10位成员评分的平均值为最终得分。

1.3.3 测试指标与方法

可溶性固形物含量：手持糖度计法。

残糖含量（以葡萄糖计）：斐林试剂法[19]，10 mL斐林试剂液相当于葡萄糖51.33 mg。

维生素C（vitaminC，VC）含量：2,6-二氯酚靛酚滴定法[19]。

澄清度：比色法。用可见分光光度计，在波长680 nm条件下，用1 cm比色杯测定透光度（T%），蒸馏水做空白。

色度：比色法。用可见分光光度计，在波长520 nm条件下，用1 cm比色杯测定吸光度值（A），蒸馏水作为空白。

酒精度：蒸馏法。用容量瓶取100 mL酒样于500 mL蒸馏瓶中，50 mL水洗容量瓶并并入蒸馏瓶中，收集馏出液100 mL，冷却后用酒精计测量并按20℃校正。

1.3.4 数据处理

所有试验指标测定3次，取平均值；试验数据用Excel软件处理。

2 结果与分析

2.1 橘子酒酵母的分离、纯化及形态鉴定

反复进行多次分离、纯化，得到了符合酵母特征的初筛酵母菌4株，分别命名为JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4。4株菌株在PDA培养基上30℃培养3 d后，观察其菌落形态，酵母的菌落及个体形态结果如表2所示。

表2 酵母的菌落及个体形态Table 2 Colonies and individual morphology of yeast strains

由表2可知，从橘子中分离出天然野生酵母，且其菌落特征和菌体特征都差不多相似，同属于圆形酵母属。

2.2 橘子酒酵母的初步筛选

2.2.1 酵母发酵力的确定

将筛选出的酵母菌株，分别接入橘子汁培养基中，25℃恒温培养，连续7 d测发酵液质量损失，至相邻两次质量之差小于0.2 g为发酵终点，终止发酵。判断酵母发酵力，具体情况如表3所示。

由表3可知，各菌株在25℃条件下恒温发酵7 d后，发酵液质量损失分别为：菌株JZ-1 11.83 g、JZ-2 9.78 g、JZ-3 10.84 g、JZ-4 10.13 g。由发酵液质量损失大小即CO2释放量可知，不同菌株利用蔗糖发酵产生酒精的能力各不相同，即各菌株的发酵力不同。由表3可以看出，各发酵液质量损失率大小如下：JZ-1酵母＞JZ-3酵母＞JZ-2酵母＞JZ-4酵母。所以菌株JZ-1的发酵力最强。

表3 不同菌株发酵液质量变化Table 3 Mass changes of fermentation must by different yeasts

分别将各菌株的扩大培养液按5%的体积比接入到200 mL橘子汁中，摇匀后放入25℃培养箱中恒温发酵7 d。测定发酵酒液糖含量，其含量变化结果见图1。

图1 各菌株发酵期间发酵液的降糖速度比较Fig.1 Sucrose-decreasing speed comparison in fermentation must by different yeasts

由图1酒液残糖含量变化曲线可以看出，菌株JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4在蔗糖含量为20%的橘子汁发酵醪中迅速发酵，起酵时间基本一致，均为1 d。酵母菌JZ-1发酵速度快，降糖彻底（第7天糖含量已降至7.2%），发酵能力强，最终酿造酒精度高；JZ-4酵母菌发酵速度较慢，至第5天后降糖速度趋于平缓，残糖含量高（第7天糖含量仍为8.3%），酒精度较低；而酵母菌JZ-2发酵速度接近酵母菌JZ-4（第7天糖含量为8.0%），发酵速度较缓慢，酒精度较低；JZ-3酵母介于JZ-1酵母和JZ-2酵母之间（第7天糖含量为7.5%），发酵能力较强，最终酿造酒精度较高。

相对而言，菌种发酵力越大，它的发酵速度越快而且越彻底，而酒中残糖含量就越少，发酵性能越优良。菌株JZ-1的发酵性能最好。

2.2.2 产酒色度测定

将发酵好的橘子酒进行澄清，用紫外分光光度计在波长520 nm下测定各菌种发酵酒液的吸光度值，结果如表4所示。

表4 各酵母发酵酒的色度Table 4 The color density of orange wine fermented by different yeasts

橘子酒透明，色泽为黄色或金黄色为佳，酒的吸光度值越大，酒体色泽相对越差。如表4可知，各菌酿造的橘子酒吸光度值大小为JZ-4＞JZ-3＞JZ-1＞JZ-2。酵母菌JZ-2酿造橘子原酒，色泽为淡黄色，酒体透明；酵母菌JZ-1酿造橘子原酒，色泽黄色，酒体透明度较好；酵母菌JZ-3和JZ-4酿造的橘子原酒呈深黄色，酒体略浑浊。就色泽来说，酵母菌JZ-1和JZ-2酵母所酿原酒的酒色最好。

2.2.3 综合评定

根据各筛选酵母菌酿酒感官评分标准要求，对筛选出的4株酵母菌所酿原酒进行感官评定，具体评定结果见表5。

表5 各酵母菌酿造的橘子酒感官评价Table 5 Sensory evaluation of orange wine fermented by different yeasts

由表5看出，各初筛菌种发酵原酒感官评分由大到小顺序：JZ-1＞JZ-3＞JZ-4＞JZ-2。根据感官评价得知，酵母JZ-1为最好菌株。

综合以上的结果可以看出，酵母菌JZ-1发酵速度快，发酵力强，产酒精的能力高，色度不错，具有良好的橘子酒典型性，酿酒效果佳。酵母菌JZ-3发酵力不错，风味和色度方面较好；酵母菌JZ-2、JZ-4发酵力不强，酵母菌JZ-2风味、酿酒色度等综合性都较差，但酵母菌JZ-4酿酒橘子香味浓，典型性好。综合分析，在从橘子果实中筛选的天然野生酵母中，酵母菌JZ-1性能最佳。

2.2.4 优选菌所酿橘子酒的理化指标

对酵母菌JZ-1发酵所得橘子酒进行澄清，对其VC含量、酒精度、残糖含量、透光率等理化指标进行测定，结果见表6。

表6JZ-1酵母所酿造的橘子酒的理化指标Table 6 Physicochemical indexes of orange wine fermented by yeast JZ-1

由表6可知，酵母JZ-1酿造的橘子酒VC含量较高（含量15.4 mg/100 mL），营养价值很好；酒精度适宜（酒精度9.2%vol），降糖较彻底；酒体透明度高（透光率88.9%），色泽较好；糖量较少属于半干型，符合果酒标准[20]，是低酒精度营养型果酒。

3 结论

从橘子果肉中分离出的4种酵母菌株其菌落特征、菌体形态较为相近，内部有菌核，出芽生殖；菌落均呈白色，圆形，有一定凸起度，易挑起。4株酵母中，菌株JZ-1和JZ-3的发酵力、产酒精率性能均较强，尤以菌株JZ-1综合性能最好。酵母菌JZ-1酿造的橘子酒VC含量较高，产酒精能力强，降糖较彻底，酒体透明度高，色泽较好。综合分析认为，在从橘子果实中筛选的天然野生酵母中，菌株JZ-1的性能最佳。后期需要对菌株JZ-1进行生理生化实验及分子生物学鉴定，并进行特性研究，在此基础上优化橘子酒发酵工艺，提高橘子酒发酵品质。

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TS262.7

0254-5071（2017）05-0128-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.027

2016-11-17

湖北省教育厅科学研究计划资助项目（Q20154304）

陈清婵（1983-），女，讲师，博士，研究方向为风味食品。