金属离子对低糖酵母发酵活性的影响

程奔，李啸，*，许超群，黄聪，李建华，郑念，李勇

（1.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；3.安琪酵母伊利有限公司，新疆伊利835000）

金属离子对低糖酵母发酵活性的影响

程奔1，李啸1，2*，许超群1，黄聪1，李建华2，郑念3，李勇3

（1.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；3.安琪酵母伊利有限公司，新疆伊利835000）

该研究考察了3种金属离子对低糖酵母发酵活力的影响。首先，采用响应面设计法对酵母发酵培养基进行了优化。通过Plackett-Burman设计试验筛选出3个主要因素：镁离子（Mg2+）、锌离子（Zn2+）、锰离子（Mn2+）。在这个基础上应用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域，然后利用响应面分析法确定最佳培养基配方为酵母抽提物（FM888）10 g/L、蛋白胨（FM318）20 g/L、葡萄糖20 g/L、六水合氯化镁6.95 g/L、氯化锌1.78 mg/L、一水合硫酸锰0.069 mg/L。其次，将优化培养基配方应用于低糖酵母发酵，干酵母活力可达426.86 mL/g。经过3次平行试验的验证，实际的平均发酵活力与预测的发酵活力值相近，比优化前提高了24.8%。此研究对低糖酵母的工业化生产具有一定的指导意义。

低糖酵母；发酵活力；金属离子；最陡爬坡试验；响应面法

CHENG Ben1,LI Xiao1,2*,XU Chaoqun2,HUANG Cong1,LI Jianhua1,ZHENG Nian3,LI Yong3
(1.College of Biological and Pharmaceutical,China Three Gorges University,Yichang 443003,China; 2.Angel Yeast Co.,Ltd.,Yichang 443003,China;3.Angel Yeast Yili Co.,Ltd.,Yili 835000,China)

酵母菌通常为圆形、椭圆形或腊肠形，可以发酵多种碳水化合物，属于兼性厌氧微生物，在有氧和无氧状态下都能生存和繁衍。酵母菌细胞含有4.5%～8.5%的核糖核酸[1]、约2%的B族维生素以及多种矿物质，此外，一些酵母菌还具有富集微量元素的作用[2]。酵母菌细胞壁含有多种可以增强机体免疫力的活性物质[3]。面包酵母是一种用来发面的具有发酵活性的酵母，根据用途的不同分为高糖酵母和低糖酵母。低糖酵母不能耐受高的渗透压，在无糖条件下发酵力较高，因此适宜于含糖＜7%的面包发酵。一般用于生产咸面包、主食面包、无糖馒头、咸糕点和苏打饼干等。全球有很多国家以面包为日常主食，目前，全球消费人口超过18亿，在中国其消费量也在逐年增加[4]。随着人民生活水平的提升，低糖、低脂的烘焙食品的前景相当广阔。因此对于提高低糖酵母发酵活性的研究非常有必要。

酵母等微生物在生长过程中需要依靠无机盐来维持细胞的渗透压，同时各种矿物质元素如钙、铁、锌、锰等对酶及酶活等的作用有着重要影响[5-9]。华艳艳等[10]研究表明，在种子培养基中添加Mn2+能明显提高红发夫酵母的β-D-葡萄糖苷酶的活性并改变细胞的形态；在发酵培养基中添加0.1 g/L Mn2+，能明显促进细胞生长及虾青素合成；吴泽柱等[11]研究表明，对培养基营养盐进行优化可以有效地提升酵母发酵力；卞芙蓉等[12]研究表明，在培养基中加入一定量的金属离子对于提高谷胱甘肽产量具有良好的效果。

培养基优化方法众多，其中以响应面法的效果最好[13]。响应曲面设计方法（response surface methodology，RSM）是通过对回归方程的分析从而寻求最优工艺参数，来解决多变量问题的一种方法，同时也是优化条件、降低成本、提高效率、解决生产实际等问题的一种切实有效的统计方法[14-17]。本研究主要采用了Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡路径法以及响应曲面设计方法探讨了8种金属离子对低糖酵母发酵活性的影响，并得到优化的培养基配方。此研究对低糖酵母的发酵生产具有一定的理论和实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）FX-2、酵母抽提物（FM888）、蛋白胨（FM318）：安琪酵母股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母抽提物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20g/L。若配制YPD固体培养基，在YPD培养基中加入20g/L琼脂粉。培养基在115℃条件下灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

ZHWY-211D脚踏开门型大容量全温度恒温摇床：上海智城生物科技有限公司；TDL-60B型飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂制造；SPX-150生化培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；双向三速打面机：美国Hobart公司；SJA发酵力测定仪：瑞典SJA公司。

1.3 方法

1.3.1 甘油菌制备

从生产线上取低糖酵母种子，用一定量的蒸馏水稀释成菌悬液，将菌悬液按照梯度进行稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），用100 μL移液枪从不同梯度稀释液中取0.1 mL液体注入平板培养基（YPD固体培养基）上，用涂布棒涂抹均匀后将平板盖好，倒置放于28℃恒温箱中培养72h，每个稀释梯度3个重复。选出具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，在分离培养基（YPD琼脂培养基）上划线2～3次，进行纯化。分离纯化得到的单菌落接入装有100mLYPD培养基的250mL摇瓶中，在温度为28℃、摇床转速为180r/min条件下培养20 h[18]。将培养好的菌液与灭菌后的甘油按照7∶3比例混合，摇匀后于-20℃条件下保藏。

1.3.2 发酵方法及培养条件[18]

将实验室保藏的低糖酵母菌种用YPD斜面活化，恒温培养箱中28℃培养2～3 d。将活化好的斜面接种到YPD液体培养基，在温度为28℃、摇床转速为180 r/min条件下培养30 h，获得液体种子。试验培养基中接入5%的液体种子，在温度为28℃、摇床转速为180 r/min条件下培养20 h。

1.3.3 无糖酵母发酵活力测定[19]

利用布氏漏斗进行发酵液抽滤，至无水为止，获得鲜酵母；称取4.0 g氯化钠至250 mL三角瓶中，加入150 mL蒸馏水溶解，制成浓度为2.7%的盐水溶液。称取280.0 g中筋小麦粉，倒入和面机内，另称取6.0 g鲜酵母于50 mL小烧杯中，加入少许上述盐水溶解鲜酵母，将溶解后的鲜酵母倒入和面机面粉中，并用剩下的盐水溶液将烧杯壁上残余的鲜酵母洗涤干净后全部倒入和面机中面粉上，计时，混合搅拌5 min，控制面团温度为（30±0.2）℃，将面团放入SJA发酵仪的不锈钢盒中，送入活力室内。发酵温度为（30±0.2）℃，调节记录仪零点，关闭放气小孔，从和面开始后第7分钟后开始计时，记录第1、第2、第3小时面团产生的二氧化碳气体量，以第2、第3小时面团产生的二氧化碳气体量之和为该酵母的发酵力，结果用毫升数表示。在本研究中采用的是每克干酵母的活力值作为响应值，因此将实际检测活力进行折算。折算方法为每克干物质含量对应活力值=实际检测活力值/样品干物质含量

1.3.4 响应面法优化培养基配方

根据Plackett-Burman试验设计找出的显著因素，进行最陡爬坡试验，需要先逼近最佳区域后才能建立有效的响应面方程。最陡爬坡法实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域。

1.3.5 Plackett-Burman试验设计

试验选用N=12和因子数（N-1）为11的试验设计，把每个因素设计成高（+1）和低（-1）2个水平，根据文献查阅，确定了铜离子（A）、钠离子（B）、镁离子（D）、钾离子（E）、亚铁离子（G）、钙离子（H）、锌离子（J）、锰离子（K）这8个因素作为PB试验的考察对象。

1.3.6 最陡爬坡试验设计

根据Plackett-Burman试验结果各显著影响因素效应的大小设定步长及变化方向，以快速逼近最佳区域。而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小确定，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。找到低糖酵母活力最高的处理，即为下一步响应面分析的中心点。

1.3.7 响应面分析试验

根据最陡爬坡试验结果，显著因素以中心点为零水平，高水平和低水平分别比零水平高于或低于一个实际步长，用DesignExpert软件设计中心组合试验并进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计结果

使用Minitab16软件进行Plackett-Burman试验，选择了试验次数N=12和因子数（N-1）为11的试验设计，以C、F、I作为空项来估计试验误差，其中A、B、D、E、G、H、J、K则分别代表铜离子、钠离子、镁离子、钾离子、亚铁离子、钙离子、锌离子、锰离子，每个因素取高低两个水平，以每克干物质含量对应的活力值作为响应值，Plackett-Burman试验的因素与水平见表1。这些离子是分别以CuSO4·5H2O、NaCl、MgCl2·6H2O、KCl、FeCl2、CaCl2、ZnCl2、MnSO4·H2O的形式加入到培养基中。

表1Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表2为Plackett-Burman试验设计及结果，对表2结果进行方差分析，结果见表3。由表3可知，各因素对结果的影响（En）就是该因素高（Rh）和低（Rl）结果之差的平均值，即En=（Rh-Rl）/6。t检验是用来比较真实变量和名义变量效应之间的显著性，从而判断该因素的相对重要性。由表3可以看到，各因素所代表的参数、水平及T值和P值。P值越小，则说明结果与对照的差异越显著，对低糖酵母发酵活力具有显著影响的因子依次是K＞J＞D，即锰离子＞锌离子＞镁离子，确定这三个因素作为下一步试验的关键因素。

表2Plackett-Burman试验设计与结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3Plackett-Burman试验结果分析Table 3 Analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 最陡爬坡试验

对表3中各因素的P值进行比较可以发现，D、J、K3个因素P值最小，因此相对差异性最显著。再根据最陡爬坡试验结果可以估计系数的正负效应，结果见表4。由表4可知，随着锌离子浓度逐渐减小，锰离子、镁离子浓度逐渐增大，低糖酵母发酵活力呈现先增大后减小的变化。当镁离子质量浓度在900 mg/L，锌离子质量浓度在0.8 mg/L，锰离子质量浓度在0.024 mg/L时，低糖酵母发酵活力达到最大，因此将第3组试验的条件作为响应面试验水平的中心点。

表4 最陡爬坡试验结果Table 4 Results of the steepest ascent experiments

2.3 响应面分析法

以镁离子900mg/L，锌离子0.8mg/L，锰离子0.024mg/L为中心点，以每克酵母干物质对应的活力值作为响应值进行响应面分析，各自变量水平见表5，Box-Behnken试验设计结果见表6，方差分析结果见表7。由表7可知，回归模型的P值（Prob＞F）=0.005，这表明该模型是显著的；而失拟值3.05＜4，则表明该模型失拟现象不显著；根据表中的P值还可以看到，该模型的线性、平方的影响是显著的，但交互作用影响不显著。可知该模型的回归系数R2=0.961 4，R2adj=0.891 8，表明模型拟合度很好。经回归拟合后，得到二次多项式方程：

表5 响应面试验设计因素与水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments design

表6Box-Behnken试验设计结果Table 6 Results of Box-Behnken experiments design

表7Box-Behnken设计方差分析Table 7 Variance analysis of Box-Behnken design

根据上述拟合回归方程作出响应分析图，结果见图1。由图1可知，响应面最高点表示活力的最大预测值，由锌离子与镁离子及锰离子的交互作用可以看出，锌离子、镁离子、锰离子趋近于某一浓度时，酵母发酵活力有最大预测值，即发酵活力的模型方程有最优解。说明该模型设计合理。

图1 不同含量锌离子、镁离子、锰离子交互作用对酵母活力影响的响应曲面和等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between different concentrations of Mg2+, Zn2+and Mn2+on yeast activity

2.4 验证性试验

根据求得的最优回归方程和试验结果，得到最优的金属离子组合：六水合氯化镁质量浓度为6.949 g/L、氯化锌质量浓度为1.780mg/L、一水合硫酸锰质量浓度为0.0687mg/L，酵母活力可达426.859 mL/g。为了验证优化的可靠性，在该浓度下进行了重复摇瓶试验，试验重复3次，结果分别为424.5mL/g、420.66mL/g、428.3mL/g，平均值为424.487mL/g，与预测值426.859 mL/g接近，二者的良好拟合性证实了模型的有效性。优化后得到的低糖酵母发酵确定最佳培养基配方为酵母抽提物（FM888）10g/L，蛋白胨（FM318）20g/L，葡萄糖20 g/L，六水合氯化镁6.949 g/L、氯化锌1.78 mg/L、一水合硫酸锰0.068 7 mg/L。

3 结论

本研究通过Plackett-Burman试验从众多金属离子中筛选出了3种对低糖酵母发酵活力有显著影响的因子及浓度范围，进一步通过最陡爬坡路径试验确定响应值区域，最后通过响应面设计、Design-Expert软件分析，得到优化确定最佳培养基配方为酵母抽提物（FM888）10 g/L、蛋白胨（FM318）20 g/L、葡萄糖20 g/L、六水合氯化镁6.949 g/L、氯化锌1.780 mg/L、一水合硫酸锰0.068 7 mg/L。在摇瓶中进行验证试验，得到优化条件下酵母干物质活力平均值为424.487 mL/g，优化后每克干物质发酵活力提高了24.8%，对低糖酵母活力的提升具有明显效果，对于低糖酵母的生产有一定的指导作用。

[1]俞灿，郑国斌，姚娟，等.富含核糖核酸酿酒酵母的选育及其高密度发酵工艺[J].中国酿造，2016，35（12）：66-71.

[2]李成鹏，张超，刘玉倩，等.酵母细胞对溶液中Co和Cd的生物富集[J].环境工程学报，2015，9（3）：1501-1506.

[3]倪靖岳.酵母甘露聚糖的生产技术研究[D].石家庄：河北科技大学，2015.

[4]曹小红，崔云前，张林军，等.上面酵母酿造特性的研究[J].中国酿造，2010，29（6）：25-27.

[5]李建华，李啸，张娅，等.金属离子对卤醇脱卤酶发酵生产的影响[J].中国酿造，2012，31（3）：132-136.

[6]DING R,LI Z,CHEN S,et al.Enhanced secretion of recombinant α-cyclodextrin glucosyltransferase fromEscherichia coli,bymedium additives [J].Process Biochem,2010,45(6):880-886.

[7]彭哲，张嗣良.中心组合设计优化东方拟无枝酸菌发酵生产万古霉素的微量金属离子[J].化学与生物工程，2011，28（4）：65-69.

[8]宋拓，李俊俊，唐湘华，等.响应面分析法优化β-环糊精的制备工艺[J].中国酿造，2013，32（1）：84-89.

[9]罗宇笛，李啸，张江，等.金属离子对重组大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响[J].天津农业科学，2014，20（12）：10-15.

[10]华艳艳，孙玉梅，曹芳，等.金属离子对红发夫酵母的生长、细胞形态及虾青素合成的影响[J].食品科学，2006，27（3）：137-141.

[11]吴泽柱，盛艳.玉米糖浆代替糖蜜为碳源的酵母发酵培养基的优化[J].中国食品添加剂，2014（1）：178-182.

[12]卞芙蓉，劳兴珍，郑珩，等.酵母发酵生产谷胱甘肽的培养基优化[J].中国生化药物杂志，2009，30（3）：184-186.

[13]刘志祥，曾超珍.响应面法在发酵培养基优化中的应用[J].北方园艺，2009（2）：127-129.

[14]杨迎凤，杨文娟，杨锟，等.响应面法优化酵母菌产胞外多糖培养基的研究[J].中国酿造，2014，33（9）：115-119.

[15]王晓霞，赵晨，赵祥颖，等.响应面法优化假单胞菌产胞外多糖发酵培养基[J].中国酿造，2016，35（3）：80-83.

[16]刘丽莎，陶国琴，郭宏，等.响应面法优化豆乳链球菌增殖培养基[J].食品科学，2014，35（11）：124-128.

[17]郭法利，欧杰.响应面法优化普鲁兰多糖发酵培养基[J].微生物学杂志，2014，34（5）：55-60.

[18]康远军，杨华，李欣，等.基于响应面法的鲁氏酵母发酵培养基优化[J].中国酿造，2015，34（4）：25-29.

[19]于景芝.酵母生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2005：669-670.

Q93-335

0254-5071（2017）05-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.011

2017-03-12

湖北省自然科学基金（ZRS2015000013）

程奔（1989-），男，硕士研究生，研究方向为微生物发酵过程控制。

*通讯作者：李啸（1969-），男，副教授，博士，研究方向为微生物反应过程优化与控制。