降脂保肝颗粒药材共提后人参皂苷类成分变化的初步研究

王仁广 张蕊多 石 薇 王 畅 邱智东 贾艾玲长春中医药大学药学院,吉林 长春 130117

降脂保肝颗粒药材共提后人参皂苷类成分变化的初步研究

王仁广 张蕊多 石 薇 王 畅 邱智东 贾艾玲*
长春中医药大学药学院,吉林 长春 130117

目的：利用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质(HPLC-Q-TOF-MS/MS)联用技术研究人参复方制剂降脂保肝颗粒中人参与山楂等药材共提前后皂苷类成分的变化。方法：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱(250mm×4.6 mm，5μm)，流动相以乙腈-水梯度洗脱，负离子模式采集质谱数据，比较不同提取方法及配伍制备的共提液中皂苷类成分的变化趋势。 结果：在pH小于3时，人参与山楂等不同配伍共提液中皂苷类成分水解，发生转化，稀有皂苷的含量明显增加。结论：在人参与山楂配伍提取过程中酸性对皂苷成分的影响较大，可为人参皂苷在酸性条件下更准确的应用提供理论基础。

人参；山楂；高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱；共提取；人参皂苷

中药复方配伍理论及变化规律是中医药理论研究的热点。中药复方疗效的发挥与其中的活性成分或活性成分群的发挥作用密切相关。复方在发挥各药药理综合作用的同时，多药共提过程中不同物质充分反应，可能发生增溶及化学成分的变化，从而产生特殊的药效活性。药对，是指药物间最基本的配伍形式，是组成方剂的基本要素，有时也是最简单的方剂，其临床应用也一直被广泛研究[1-5]。降脂保肝颗粒是白求恩医科大学制药厂联合长春中医药大学与吉林大学共同研发的具有治疗脂肪肝作用的中药六类新药。是由水飞蓟、人参、山楂、丹参等四味中药组成的复方制剂。人参是我国常用中药之一，为五加科植物人参 (PanaxginsengC.A.Mey.) 的干燥根和根茎。人参的主要有效成分为人参皂苷类物质，其中主要活性成分人参皂苷Rg1、Rb1、Re是《中国药典》2015版规定的人参药材含量测定指标[6]。据文献报道，人参皂苷低剂量对慢性肝损伤有一定保护作用，人参皂苷高剂量能明显减少肝组织胶原的沉积，改善肝纤维化程度，具有抗肝纤维化作用[7-9]。山楂为药食同源的植物，主要具有调节血脂、保肝、降压、助消化等作用，应用十分广泛[10]。文献报道，山楂有效成分主要有黄酮类、黄烷及其聚合物类、有机酸类、三萜类等[11]。其中山楂的黄酮类成分如金丝桃苷、熊果酸具有明显的降低胆固醇、调节血脂的作用[12-13]。人参山楂配伍组方可以增强降脂保健作用。人参与一些中药共煎后人参皂苷会发生变化。如人参与黄连共煎时，黄连提供的中碱性条件使人参皂苷类成分水解生成齐墩果酸型苷元[14-16]。本研究用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)联用考察人参在与山楂共提过程中人参皂苷类成分的变化，为人参-山楂配伍组合的药效物质基础研究提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260 高效液相色谱仪；Agilent 6520Q-TOF 质谱仪(美国Agilent公司)；TG328A(S)分析天平(北京斯达恒通科技有限公司)；TP-150 超声波清洗机(天鹏电子新技术有限公司)；真空干燥箱(上海-恒实验仪器总厂)。

1.2 材料 人参、山楂、水飞蓟、丹参均购自于吉林国安药业有限公司，经长春中医药大学药学院中药资源与鉴定教研室翁丽丽教授鉴定，分别为五加科植物人参 Panax ginseng 的干燥根；蔷薇科植物山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果实，；菊科植物水飞蓟Silybummarianum(L.)Gaertn.的干燥成熟果实；唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎。人参皂苷Rg1、Rb1、Re对照品(批号分别为110703-201529、110704-201424、110754-201525)。无水乙醇为分析纯(北京化工厂)；乙腈、甲酸均为色谱纯(美国Thermo Fisher公司)；水为纯净水(娃哈哈公司)。

2 方法与结果

2.1 液质-联用(LC-MS)条件

2.1.1 色谱条件 选用ZORBAX SB-Aq色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的程序进行梯度洗脱，进样量10μL，流速1mL /min。

表1 高效液相色谱洗脱梯度条件

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(electronic spray ion, ESI)；负离子检测模式；喷雾器压力为207 kPa；干燥气(N2)流速：10L/min；干燥气温度：350℃；毛细管电压：3500V；碎裂电压：175 V；锥孔电压：65V；质量检测范围：300～1400m/z。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 降脂保肝颗粒 称取降脂保肝颗粒适量，研细，取粉末1g，精密加入10mL石油醚(60～90℃)，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，滤过，弃去滤液，药渣挥干溶剂，精密加入10mL甲醇，超声处理30min，滤过，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 人参单煎液 称取人参药材10g，水煎1h，药液过滤之后加醇使之含醇量达到75%，过滤，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 人参-山楂合煎液 称取人参药材10g与山楂药材20g合并水煎1h，药液过滤之后加醇使之含醇量达到75%，过滤，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 人参-山楂与醇提后的丹参-水飞蓟药渣合煎液 称取人参10g,山楂20g，与醇提后的丹参药渣15g,水飞蓟药渣10g合并水煎1h，药液过滤之后加醇使之含醇量达到75%，过滤，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2.5 人参-山楂超声醇提液 称取人参10g,山楂20g，用75%乙醇超声提取(功率250W，频率40kHz)，药液过滤，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2.6 人参-山楂与醇提后的丹参-水飞蓟药渣超声醇提液 取人参药材10g,山楂20g,醇提后的丹参药渣15g,水飞蓟药渣10g，用75%乙醇超声提取(功率250W，频率40kHz)，药液过滤，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.3 结果分析

表2 样品pH值

样品序号123456pH4.25.12.73.84.44.4

3 讨论

研究降脂保肝颗粒工艺时，根据药物成分的性质等要求选择水飞蓟、丹参以乙醇提取，药渣与人参、山楂合并水煎煮。由于人参是君药，故前期考虑将人参皂苷作为制剂质量标准控制指标，但由于山楂中含有酸性物质，在煎煮过程中可能会对人参皂苷类成分的检测产生影响，故通过实验展开研究。

由图1～6和表2可知，图1降脂保肝颗粒样品液质联用色谱中无Rg1、Re峰出现，其他样品中，pH值对人参皂苷Rg1与Re的峰面积影响较大；图2中，人参单煎可以检出Rg1与Re；图3即人参山楂合煎样品的pH小于3，Rg1与Re的峰面积大幅度减少，但其中48～50min位置出现了一些稀有皂苷色谱峰，说明人参皂苷进行了转化；图4中，加入的醇提后的药渣共煎起到了一种缓冲体系作用，使药液酸性强度减小，Rg1与Re转化程度相对较小。图5和图6采用的超声处理方法，pH均为4.4，Rg1与Re转化程度较小。

人参与不同中药配伍，煎煮液的pH 值会随着配伍中药的不同而改变，从而影响人参皂苷的溶出和种类的变化。当pH小于3时，人参皂苷会进行转化。理论上在酸性条件下加热，人参二醇型皂苷、人参三醇型皂苷、齐墩果酸型皂苷会发生转化，生成人参二醇、人参三醇、齐墩果酸[17-19]。由实验结果显示出，药液中Rg1、Re含量很低，几乎全部转化，但仍可在液质联用中检测出。分析皂苷成分可能是在加入醇提液后浓缩、干燥过程中发生了变化。药液在浓缩过程中受热时间过长，加之酸性的影响，皂苷可能会转化。但若尝试在浓缩前调节药液pH值，则会影响酸性有效成分的保留。因此，通过实验研究得出，降脂保肝颗粒在质量标准研究时不建议将测定人参中的人参皂苷等指标性成分列入标准。人参、山楂两味中药广泛用于多种中药复方中，具有协同作用。研究为人参与山楂配伍进一步研究提供了一定的实验依据，可以为中药复方制剂分析、中药组方原理研究及临床治疗药物检测提供一些理论参考。

[1]张荣，刘睿，黄天来，等. HPLC法研究当归-红花单煎及共煎液中有效成分含量的变化[J]. 中药新药与临床药理，2009，20(5)：448-452.

[2]曾惠芳，苏子仁，史俏蓉，等. 虎杖单煎、复方共煎过程中的物理化学变化初探[J]. 中国药房，1999，10(3)：112-113.

[3]赵奎君，李卓明，陈小莺，等. 从当归补血汤的研究探讨和分析中药复方共煎的合理性[J]. 世界科学技术—中医药现代化，2009，11(2)：294-297.

[4]苏子仁，陈建南.中药制剂工艺过程的物理化学变化研究[J]. 中国中药, 1998, 24(11):671.

[5]王曼华，孙化萍，梁建卫. 经方“药对”配伍理论研究概况[J]. 辽宁中医药大学学报， 2008， 10(1): 59-60.

[6]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部) [S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：8-9.

[7]黎阳，张铁军，刘素香，等. 人参化学成分和药理研究进展[J]. 中草药，2009，40(1)：164-165.

[8]冯彦. 人参药理作用及临床应用研究进展[J]. 中医临床研究，2013，5(6)：121-122.

[9]张彩，史磊. 人参化学成分和药理作用研究进展[J]. 食品与药品，2016，18(4)：301-303.

[10]楼陆军，罗洁霞，高云. 山楂的化学成分和药理作用研究概述[J]. 中国药业，2014，23(3)：92-93.

[11]吴士杰，李秋津，肖学凤，等. 山楂化学成分及药理作用的研究[J]. 药物评价研究，2010，33(4)：316-317.

[12]陈佳，宋少江.山楂的研究进展[J].中药研究与信息，2005,7(7)：21-22.

[13]于蓓蓓，闫雪生，孙丹丹. 山楂药理作用及其机制研究进展[J]. 中南药学，2015，13(7)：746-748.

[14]张千娥. 山楂大枣黄芪方治疗慢性肝炎的临床效果观察[J]. 中药材，2014，37(10)：1902-1903.

[15]王春兰，刘婷，陈真丽. 山楂人参颗粒剂的制备及质量标准研究[J]. 中医药信息，2014，31(6)：56.

[16]单晨啸，文红梅，于生，等. UFLC /Q-TOF-MS 结合主成分分析法考察人参与黄连共煎前后人参皂苷类成分的变化[J]. 中国实验方剂学，2015，21(1)：24-25.

[17]ZHANG X，WANG L N，SONG F R， et al. Study on the variation of chemical constituents during combination of ginseng with trogopteroum feces and semen raphani by high performance liquid chromatography mass spectrometry[J]. Chinese J Anal Chem，2007，35(4)：559-563.

[18]ZHANG Chunzhi，LI Dai，YU Hongshan，et al.Purification and characterization of picied-β-glucosi-dase from Aspergillus niger[J]. Process Biochem，2007，42(1)：83-88.

[19]QIAN Siri，YU Hongshan，ZHANG Chunzhi，et al. Purification and characterization of dioscin-alpha-L-rhamnosidase from pig live[J]. Chem PharmBull,2005，53(8)：934-937.

Preliminary Study on the Changes of Ginsenosides Before and After Co-extraction of Ginseng and Hawthorn in Jiangzhi Baogan Granules

WANG Renguang ZHANG Ruiduo SHI Wei WANG Chang QIU Zhidong JIA Ailing*

Pharmacy College,Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117,China

Objective To study the change of saponins before and after co-extraction of ginseng and hawthorn in ginseng compound preparation Jiangzhi Baogan Granules by high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS / MS). Methods Chromatographic separation was performed on a Zorbax SB-Aq column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a gradient elution of acetonitrile-water, and the mass spectrometry data were collected in the negative ion mode to compare the variation of saponins prepared in different extraction methods and compatibility. Results When the pH was less than 3, saponins in different compatibility of ginseng and hawthorn made a hydrolysis performance, along with the conversion,and the amount of rare saponins had increased significantly. Conclusion The effect of acidity on the saponin components in the process of co-extraction of Ginseng combined with Hawthorn and their compatibility is significant, which can provide a theoretical basis for the more accurate application of Ginsenosides in acidic conditions.

Ginseng;Hawthorn;High Performance Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry; Co-extraction;Ginsenoside

吉林省科技厅医药产业发展专项资金项目(20130727003YY)。

王仁广(1993-)，男，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药制剂。E-mail: 727736000 @qq.com

贾艾玲(1986-)，女，朝鲜族，讲师，硕士，研究方向为中药制剂。E-mail: 171265932 @qq.com

R284

A

1007-8517(2017)06-0025-04

2017-01-12 编辑：穆丽华)