橡胶树胶胞炭疽菌T—900突变体生物学研究及其假定基因LV1敲除载体构建

郑肖兰 李秋洁 郑行恺 刘先宝 李博勋 时涛 黄贵修

摘 要 从构建的橡胶树胶孢炭疽菌RC178（Colletotrichum gloeosporioides）突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱突变体T-900，与野生菌株相比其菌落生长速率、产孢能力，孢子萌发率及附着孢形成率均明显降低。通过对突变菌株T-900 T-DNA侧翼序列克隆、比对和基因预测结果表明外源片段的插入破坏了一个预测基因的功能，该基因和组蛋白H3同源性为99%，暂命名为LV1。通过同源臂克隆构建了该基因敲除载体900-1A-900-1B-pCT74，为进一步研究该基因在病原菌致病过程中的作用机理提供了基础。

关键词 胶孢炭疽菌；T-900；生物学特性；基因敲除载体；转化与再生

中图分类号 S432.1 文献标识码 A

Abstract A mutant strain T-900 with weakened virulence to rubber trees was obtained from T-DNA insertion mutation library， and the conidia sporulation rate， spore germination and appressorium formation rate of T-900 were significantly lower than the wild-type stain RC178. The T-DNA flanking sequence of T-900 was obtained by TAIL-PCR and compared with the whole genome of C. gloeosporioides by sequence alignment. The results showed that the sequence in which the T-DNA was inserted contains a gene that was designated as LV1， The gene and histone H3 homology were 99%. In order to study the function of the pathogenicity gene LV1， The gene knockout vector 900-1A-900-1B-pCT74 was successfully constructed by homologous cloning and restriction endonuclease digestion. This method was successfully used to construct a high efficient gene knockout system of LV1， which provides a technical platform for the functional verification of the pathogenic genes of Colletotrichum gloeosporioides.

Key words Colletotrichum gloeosporioides； biological characteristics； T-900； gene knockout vector； transformation and regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.022

天然橡膠是一种世界性重要工业原料和重要战略物资[1-3]。蔡志英、孙董董等发现由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染引起的炭疽病是橡胶生产中常发的重要叶部病害，产量损失巨大[3-5]。刘艳等[6]发现胶孢炭疽菌几乎可以在所有作物上引起炭疽病害，造成严重的经济损失。

由于炭疽病寄主范围广、传播途径多、存活时间长、生理小种变异多等，蔡志英等发现炭疽病一旦大面积发病后很难利用药剂进行防治[7-8]。培育和推广抗病品种是一种经济、安全、有效的措施，但多年来，利用常规育种方式很难得到对炭疽病菌耐病或高抗的品种[9]。所以目前从分子方面研究其致病基因显得尤为重要，通过对炭疽菌分子致病机制的研究，希望能为病害的防治和品种抗病性的保持提供新的思路和途径[1，9]。许多真菌包括胶胞炭疽菌的大规模测序工作为人们提供了大量的EST序列、ITS序列、全基因组序列等信息，其中大部分基因仍然是功能未知基因，通过现有数据库进行序列比对分析仅能预测出其假设功能，而利用基因敲除方法可为研究基因功能提供最直接有利的证据[10-11]。

基因敲除是研究基因功能最具说服力的分子遗传操作方法之一，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计一系列实验，将该基因去除，然后从整体观察突变体的表型性状，通过分析突变体表型而明确基因功能的方法[9，12]。笔者研究团队已经获得农杆菌介导的遗传转化体系在胶孢炭疽菌成功应用，获得1个致病相关突变体T-900，生物学特性研究发现其与野生型菌株RC178存在明显差异，对其插入位点基因拟命名为LV1。为了研究假设基因LV1的功能，目前迫切需要一个十分高效的基因敲除策略来研究各个基因对于致病性和次级代谢物方面的影响。本实验将潮霉素标记技术引入到炭疽菌基因敲除载体中。利用该载体，筛选在潮霉素选择压力下能正常生长的转化子，提高转化子的筛选效率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体（T-900）及其野生型菌株RC178均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所保存；突变体T-900致病力明显减弱，且T-DNA单拷贝。

主要试剂：潮霉素B（Roch）、Tap酶（北京天根生物公司）、T4 DNA连接酶（大连宝生物）、溶壁酶（广东碧德）、氨苄青霉素（Solarbio）、PEG3350（Sigama）、胶回收试剂盒和PCR回收试剂盒（Omega）等。

培养基：MM培养基、CM培养基、LR培养基等配置方法参照蔡志英博士论文[1]。

1.2 方法

1.2.1 突变菌株T-900的生物学性状分析 胶孢炭疽菌突变菌株T-900致病力测定：参照刘艳的方法[6]；菌落形态及生长速率测定方法参照郑肖兰论文[13]；产孢量及孢子形态测定方法、孢子萌发率和附着胞形成率的观察方法参照刘艳论文[6]。

1.2.2 突变菌株T-900的T-DNA测定分子检测

原理是依据T-DNA（其中包含1个潮霉素及其启动子的片段，插入结构如图1）随机插入到炭疽菌野生型RC178 DNA中，具体方法参照刘艳论文[14]。检测所用hph通用引物为Hf：5′-GGTAATGGT AACGCCATGCTCCTT-3′，Hr：5′-CCATTACTGCA ACACTCGAGGCT-3′，以RC178、T-900和AGL-PT的基因组为模板进行PCR检测。

1.2.3 突变菌株T-900 T-DNA侧翼序列的克隆

采用TAIL-PCR[1]方法扩增T-900的侧翼序列，所采用的简并引物及其结构图和位置参照文献[15]及刘艳[14]。

1.2.4 酶切法构建LV1基因敲除载体 传统酶切法构建LV1载体示意图见图2。

（1）同源臂克隆与含酶切位点上下游片段的获得。通过T-900的侧翼序列所在胶胞炭疽菌全基因组中获取预测基因LV1，并在基因LV1开放阅读框外两侧各取1 000 bp左右的片段作为LV1基因两个同源臂A，B（记为T-900-1A、T-900-1B）的备选区域，并对其进行酶切位点分析，同时结合pCT74载体上潮霉素抗性基因两端的酶切位点选择同源臂两端合适的酶切位点。

基因LV1同源A臂5的酶切位点为ApaI，3端酶切位点为Xhol，B臂5端酶切位点为EcoRI，3端酶切位点为SacI，根据选择的酶切位点和同源臂备选区的序列，设计引物如下：

A臂：T-900-1A-F： CGGGCCCCCTGTGTCTTT GCGTTTGG ApaI

T-900-1A-R： CCCTCGAG GGAGTGATTGTGT GCCAGAC Xhol

B臂：T-900-1B-F：CGGAATTC TTCTTCTCC TTCAAAGACAAGC EcoRI

T-900-1B-R：CGAGCTC GCGTAGTCAAGAC AATACAAGA SacI

以橡胶树炭疽菌野生型RC178的基因组DNA为模板，扩增待敲除基因LV1上下游的AB臂。扩增到预期的目的条带后分别命名为：900-1A、900-1B。

将900-1A和900-1B PCR产物胶回收，回收产物连接到pMD-18T载体上，转化大肠杆菌。菌落PCR验证转化成功，挑取转化成功的大肠杆菌，摇菌过夜培养，菌液用于提取质粒送测序。经测序获得上下游基因正确的质粒，分别命名为：900-1A-T、900-1B-T；用于下步实验的双酶切。

（2）900-1A-T连接至载体pCT74。用ApaI和Xhol酶对900-1A-T、pCT74进行双酶切，酶切产物进行胶回收，将回收得到的产物连接至pCT74。然后将连接后含有目的片段pCT74转化至大肠杆菌，过夜培养，提取质粒后用ApaI和Xhol酶双酶切鉴定。鉴定正确的质粒命名为900-1A-pCT74。

（3）900-1B-T连接至载体900-1A-pCT74。用EcoRI和SacI酶对900-1B-T，900-1A-pCT74进行双酶切，酶切产物进行胶回收，将回收得到的900-1B连接至900-1A-pCT74。将连接后含有目的片段900-1A-pCT74转化至大肠杆菌，过夜培养，提取质粒后用EcoRI和SacI酶双酶切鉴定。鉴定正确的质粒命名为900-1A-900-1B-pCT74，即为LV1基因的敲除载体。

（4）结合上述酶切法验证后，将用相应的酶也能获得预测大小相等的目的片段载体送测序，利用序列正确进行再次验证。

用ApaI和SacI酶双酶切900-1A-900-1B-pCT74，获得的目的片段用于原生质体转化。

1.2.5 原生质体的制备、原生质体转化与再生

具体方法参照蔡志英[1]。

1.3 数据分析

采用SAS9.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 突变菌株T-900的生物学性状分析

2.1.1 T-900 致病性测定结果 致病性测定发现：接种后第5天观察，结果如图3：空白对照基本没有产生病斑，仅仅是培养基的印痕；T-900发病轻，病斑小；RC178则发病严重，病斑大。

2.1.2 T-900与RC178生长速率测试结果 由图4得知，RC178平均生长速率为（0.933±0.003） cm/d，而T-900则为（0.503±0.011） cm/d，明显低于野生型RC178，由此推测，菌落生长速率的减弱可能是由于T-DNA插入导致突变体代谢紊乱造成的。

2.1.3 T-900与RC178產孢量的测定及分生孢子大小观察结果 橡胶树炭疽菌主要是通过分生孢子侵染为害橡胶树，因此，产孢量的多少势必对其致病性起着举足轻重影响。从图5-A可见，T-900产孢量与RC178产孢量方差分析结果显示，在产孢能力上存在极显著差异。

通过显微镜观察并对分生孢子大小进行测量发现（图5-B），突变体T-900分生孢子形态与RC178相比，也存在变异。野生型RC178菌株分生孢子大小为（14.41±0.34） μm × （4.03±0.07） μm，长柱型或长圆型，表面光滑，两端钝圆。而T-900分生孢子大小为（10.27±0.31） μm × （5.09±0.08） μm，较短粗，呈椭圆形或短棍棒形。方差分析结果显示，突变体T-900分生孢子长度与野生型RC178差异显著。

2.1.4 T-900与RC178分生孢子萌发及附着孢形成观察结果 分生孢子萌发及附着胞形成是炭疽菌侵染寄主过程中非常关键的一步，分生孢子萌发产生附着胞才有可能再分化出一系列侵染结构侵染寄主，因此较低的萌发率或者附着胞形成率同样可能是致病性降低或者丧失的原因之一。统计了T-900与野生型RC178的萌发率和附着胞形成率：其中孢子萌发率分别为32.00%、86.00%；而附着胞形成率则分别为28.00%、80.00%，相比较均存在显著差异（图6）。

2.2 突变菌株T-900的T-DNA分子检测结果

从图7可知，参试菌株T-900和含有载体质粒AGL-PT的PCR检测结果发现均可扩增到约800 bp的潮霉素片段，而阴性对照野生型菌株RC178和空白对照则没有任何条带。表明参试的突变体基因组中确实插入了潮霉素磷酸转移酶基因hph。

2.3 突变菌株T-900 T-DNA侧翼序列克隆结果

参试简并引物AD004在T-900右边界扩增到特异条带，从图8-A可见，第3轮扩增的特异条带比第2轮的小，与理论扩增结果吻合。将PCR产物送样测序结果见图9。序列在NCBI上进行比对，结果如图8-B，与Conocephalum supradecompositum，Colletotrichum alienum，Colletotrichum ignotum的H3 gene相似性为99%，据此初步推测该T-DNA 插入位点相关基因为组蛋白H3相关基因。

2.4 酶切法构建LV1基因敲除载体

2.4.1 同源臂的克隆与含酶切位点的上下游片段的获得 同源臂的克隆和同源臂的PCR扩增结果如图10，泳道1、2均扩增到预期的目的条带分别命名为：900-1A、900-1B。对900-1A、900-1B的PCR扩增产物进行胶回收、转化、克隆、测序，测序获得上下游基因正确的质粒，分别命名为：900-1A-T、900-1B-T，用于下步实验的双酶切。

2.4.2 900-1A-T连接至载体pCT74 用ApaI和Xhol酶对900-1A-T、pCT74进行双酶切，结果获得预测的目的片段，见图11-A，此外酶切产物进行胶回收，回收得到的产物连接至质粒pCT74。将连接后含有目的片段pCT74转化至大肠杆菌，过夜培养，提取质粒后再使用ApaI和Xhol酶双酶切鉴定，结果见图11-B。酶切检测目的片断大小与预测一致的质粒送测序，鉴定正确的质粒命名为900-1A-pCT74。

2.4.3 900-1B-T连接至载体900-1A-pCT74 利用EcoRI和SacI对900-1B-T、900-1A-pCT74进行双酶切，酶切产物进行胶回收，将回收得到的900-1B连接至900-1A-pCT74。将连接后含有目的片段900-1A-pCT74转化至大肠杆菌，过夜培养，提取质粒后用EcoRI和SacI酶双酶切鉴定。经鉴定正确的质粒命名为900-1A-900-1B-pCT74，即为LV1基因的敲除载体（图12）。

2.4.4 验证 将载体送去测序，测序结果表明：900-1A-900-1B-pCT74同源上、下臂插入的方向正确，序列正确，证明LV1敲除载体构建成功。

利用ApaI和SacI酶双酶切900-1A-900-1B-pCT74后，获得的目的片段用于原生质体转化。

2.5 原生质体的制备

通过炭疽菌野生型菌株RC178孢子在CM液体培养基中的培养，以及溶壁酶的酶解，最终用1.2×STC溶液把原生质体浓度调整为1×107～3×107个/mL，获得的原生体质体形态完整、呈球形、大小比较均一、未破裂，符合原生质体转化的要求（图13）。

2.6 原生质体转化与再生

原生质体转化处理后取200 μL均匀涂抹于SR培养基平板上，培养5 d后，在SR培养基上长出多个菌落，有些菌落菌丝稀薄透明，无气生菌丝，有些菌落，相对较小，菌丝透明，但不能扩散，这类不能扩散的菌落一般认为是没有转化成功的野生型菌株。挑取能扩散的单菌落转接到潮霉素浓度为250 μg/mL的SR培养基，5 d后，挑取正常生长的菌落，在含有350 μg/mL的SR培养基进行复筛。最终获得LV1疑似突变菌株18个。其中未转化成功的转化子和RC178在含潮霉素（350 μg/mL）的培养基上培养5 d未长出菌落（图14）。

3 讨论

目前已经进入后基因组时代， 基因功能研究势必越来越受重视， 通过基因的改造和干预进行控制植物病害， 相关基因的功能研究是必经阶段。基因敲除技术是20世纪80年代后期发展起来的特异性敲除特定基因的技术，该技术定位性强， 是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方法， 使人们有可能真正按自己的设想去改造生物的遗传物质， 并能稳定遗传， 具有其他研究方法无法替代的作用， 在基础研究和实际应用中都有着广阔的前景[16]。目前对病原真菌胶胞炭疽菌的分子机制研究还相当薄弱，利用基因敲除筛选鉴定胶胞炭疽菌致病相关基因对其致病机制的研究及阐明相当重要。而基因敲除转化子的筛选是研究真菌基因敲除的关键点。本研究首先通过T-DNA插入突变技术构建了一个含有启动子潮霉素标记的农杆菌载体对胶胞炭疽菌野生型菌株RC178进行随机插入突变，获得了致病力明显减弱突变菌株T-900，并对该菌株进行了系列生物学特性研究，结果发现T-900与RC178相比较致病力、生长速率、产孢量、孢子萌发率和附着胞形成率均明显下降，据此推测T-DNA随机插入突变菌株T-900其插入位点相关基因LV1与其致病力等生物学特性表型相关，为了进一步研究该插入位点基因LV1的功能，很有必要通过对野生型菌株RC178敲除LV1进行验证，因此本研究通过传统酶切法成功构建该基因的敲除载体。本研究在构建的基因敲除载体中导入质粒pCT74，其含有1个潮霉素hygB抗性基因，使基因敲除转化子获得潮霉素抗性，通过潮霉素培养基的筛选，可直接获得基因敲除转化子。在目前研究中，有关优化转化子筛选的报道较少，其中刘晓妹[17]将含全部编码序列的CCK1毒素基因片段克隆在pMD18-T载体的克隆位点上，经酶切后反向插入潮霉素hygB基因，成功构建了CCK1毒素基因敲除载体。毛建才等[9]在一种新的大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）基因敲除载体的构建中成功构建了一个携带GFP筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体，使随机插入转化子在荧光显微镜下呈现绿色，而敲除转化子在荧光显微镜下不呈现绿色。由于该技术必须单孢分离后才能获得纯正的基因敲除转化子，相对来说也增加了大量的工作量；王晓亮[18]通过使用 USER酶克隆技术，在hph基因两侧引入USER酶特异位点，构建了一系列用于禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）基因敲除和荧光融合蛋白表达的基因敲除载体pKH-KO。但在实际操作过程中发现，不同基因重叠 PCR条件差异较大，经常出现重叠失败或者重叠扩增效率低、产物量少，不足以进行下一步转化的情況，摸索最佳条件往往花费很长时间。安乐等[19]利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法进行核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]交配型基因mat1-1敲除载体构建。此外Zeilinger[20]利用传统的PEG介导方法对深绿木霉（Trichoderma atroviride）进行转化，同源重组的频率很低，而利用农杆菌介导转化法获得了60%的同源重组转化子，成功实现了对tmkl和tga3基因非编码区的基因破坏[20]。而本方法所采用的全部是最基础的分子生物学实验技术，成功率高，更易于上手操作。虽然成功获得假定基因LV1敲除载体，但如果能把LV1基因与绿色荧光蛋白基因融合后再导入T-900和LV1缺失株中，通过荧光检测LV1基因的初步表达位置及表达量（有些基因在菌丝表达，有些基因在分生孢子表达，有些在细胞壁表达，有些在细胞核表达），并通过比较T-900和LV1缺失株中及野生型菌株RC178的基因表达差异，分析差异表达基因功能，以便更深入地了解到LV1基因的作用机制。

本试验利用反向遗传学的手段，应用传统酶切法构建了橡胶树胶孢炭疽菌T-900突变体的致病相关基因LV1敲除载体，以期通过同源重组策略敲除橡膠树胶孢炭疽菌野生型菌株RC178的LV1基因，为进一步研究该基因的功能及其他相关基因的研究奠定了基础，结果还发现这种方法对于在实验室条件下进行炭疽菌基因敲除和蛋白定位等基因功能的研究有着很大的应用前景。

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