利用小RNA深度测序技术鉴定海南南瓜病毒种类

车海彦 曹学仁 刘勇 罗大全

摘 要 2016年在海南乐东、昌江、澄迈、海口、文昌、儋州等地采集疑似被病毒病感染的南瓜叶片样品6个，将样品合并，采用小RNA深度测序技术对上述混合样本的病毒种类进行鉴定，发现样本中含有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒（Papara ringspot virus，PRSV）、黄瓜绿斑驳病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和中國南瓜曲叶病毒（Squash leaf curl China virus，SLCCNV），通过PCR方法进一步验证了深度测序结果的准确性。SLCCNV在4个样品中存在，P-CJ分离物的DNA-A和DNA-B组分全长分别为2 735 bp（登录号为MF062251）和2 722 bp（登录号为MF062252）。DNA-A和DNA-B组分均与SLCCNV分离物的同源性最高，同源性分别为89.2%～99.3%和79.1%～98.8%；P-CJ分离物与从中国植物样品中分离到的SLCCNV聚在同一进化分支上。上述研究结果表明，P-CJ是SLCCNV的一个分离物。

关键词 小RNA深度测序；海南；南瓜病毒病

中图分类号 S432.1 文献标识码 A

Abstract In 2016， 6 suspected virus-infected pumpkin leaf samples were collected from Ledong county， Changjiang county， Chengmai county， Haikou city， Wenchang county and Danzhou city， Hainan province. The above samples were pooled and analyze by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus（CMV）， Papaya ringspot virus（PRSV）， Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）and Squash leaf curl China virus（SLCCNV）were detected from the pooled sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus-specific PCR from above 6 samples. SLCCNV was detected from 4 samples， the virus isolate P-CJ was selected for further sequence analysis. The complete sequence of the DNA-A and DNA-B was determined to be 2 735 bp（MF062251）and 2 722 bp（MF062252）respectively. The DNA-A was most closely related to isolates of SLCCNV with 89.2%-99.3% nucleotide sequence identities. The DNA-B was most closely related to isolates of SLCCNV with 79.1%-98.8% nucleotide sequence identities. Phylogenetic analysis revealed that P-CJ isolate clustered with isolates of SLCCNV from China. These results confirmed this virus was an isolate of SLCCNV.

Key words Small RNA deep sequencing； Hainan； Pumpkin virus disease

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.018

中国南瓜（Cucurbita moschata）又名倭瓜，属于葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita Linn.），在中国南北方广泛种植，是海南冬季重要的北运蔬菜之一。病毒病在南瓜种植区几乎都有发生，目前中国从南瓜上鉴定出的病毒主要有：黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）、黄瓜绿斑驳病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、中国南瓜曲叶病毒（Squash leaf curl China virus，SLCCNV）等[1-8]。海南地处热带，独特的气候条件及南瓜种植面积的增加，导致病毒病发生日益严重。笔者调查发现，病毒病在海南南瓜种植区发生普遍，部分田块在生长中后期尤为严重。近年来小RNA深度测序技术已被应用于病毒和类病毒的鉴定和检测中，该技术是一种广谱的检测病毒的手段，与传统的ELISA和 PCR方法不同，不需要事先估计病毒的类型，无论是DNA病毒、RNA病毒还是类病毒，都能在一个测序反应中被检测到，科研人员利用该技术在植物和昆虫上鉴定了多种新的病毒[9-11]。目前还未见应用该技术对海南南瓜病毒种类进行鉴定的报道。本研究结合小RNA深度测序技术和PCR方法研究海南南瓜主要病毒种类，为南瓜病毒病的综合防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年1月在海南乐东、昌江、澄迈、海口、文昌和儋州采集疑似感染病毒病的南瓜叶片样本共6份，详见表1。

1.2 方法

1.2.1 南瓜叶片小RNA深度测序 文库构建与测序：将表1中6个不同症状类型的样品合并，建成1个cDNA文库池（表1）。叶片总RNA提取采用TRIzolR Reagent（Invitrogen），文库构建采用TruseqTM Small RNA sample prep Kit（Illumina），文庫回收采用6% Novex TBE PAGE gel，1.0 mm，10 well（Invitrogen），用TBS380 Picogreen微型荧光计进行定量，在TruSeq SR Cluster Kit v3-cbot-HS上进行PCR扩增，然后在Hiseq4000测序平台进行深度测序，小RNA深度测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。

生物信息学分析：利用Fastx-Toolkit软件对测序获得的原始数据进行质控分析，获得clean small RNA序列，从上述序列中挑选高质量序列进行长度分布统计，将质控后的序列进行拼接，得到contigs，将上述contigs在NCBI数据库中进行BLASTn和BLASTx比对，得到可能存在的病毒序列，对其进行统计并注释。

1.2.2 田间样品的PCR检测验证 叶片总DNA和总RNA提取：分别采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒和植物总RNA提取试剂盒，提取方法详见试剂盒说明。

cDNA合成：以提取的叶片总RNA为模板，使用TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix将总RNA反转录成cDNA。

检测引物：PRSV、CMV、CGMMV和粉虱传双生病毒（whitefly transmitted geminiviruses，WTGs）的检测引物序列和反应条件见表2。

PCR产物克隆和测序：将PCR扩增的特异性片段产物经纯化后与pMD18-T Simple 载体连接，转化到E.coli Competent Cell DH5α中，利用PCR筛选阳性克隆。序列测定委托上海立菲生物技术有限公司。

1.2.3 中国南瓜曲叶病毒海南分离物的全基因组测序分析 根据小RNA深度测序结果，设计2对背向引物SLCCNV-A1/SLCCNV-A2和SLCCNV-B1/ SLCCNV-B2（表2），分别用于扩增昌江十月田镇P-CJ样品中SLCCNV的DNA-A和DNA-B组分，PCR产物克隆和测序参照1.2.2。

采用NCBI中的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行相似性查找。采用DNAStar软件包中的MegAlign软件进行序列比较。通过MEGA6.06软件的Maximum likelihood法构建亲缘关系树，bootstrap replications值为1 000。

2 结果与分析

2.1 南瓜病毒病田间主要症状表现

海南南瓜病毒病田间主要表现为斑驳、曲叶、褪绿、皱缩、叶肉组织退化、节间缩短等症状，感病植株经常同时表现几种症状。6份样品的田间症状见图1。

2.2 感病南瓜叶片小RNA深度测序发现的病毒

南瓜叶片样本小RNA深度测序共产生24 450 144条reads，经质量控制之后得到21 442 277 clean reads。提取长度为18～32 nt的序列进行拼接组装，得到7 036个contigs，268个contigs可以比对到4种病毒序列，其中135个contigs可以比对到PRSV序列，同源性在83.12%～100.00%；61个contigs可以比对到SLCCNV序列，同源性在90.77%～100.00%；42个contigs可以比对到CMV序列，同源性在80.00%～100.00%；30个contigs可以比对到CGMMV序列，同源性在79.00%～100.00%。

2.3 田间样品的PCR验证

为了验证小RNA深度测序结果的可靠性，利用PRSV、CGMMV、CMV和WTGs的特异性引物（表2）对采集的6个样本进行了PCR检测，扩增到与预期大小一致的特异性条带（图2），对上述特异性扩增产物进行测序及进一步分析。结果表明，PRSV在P-CM和P-HK 2个样品中存在，GenBank登录号分别为MF772332，MF772333；CGMMV在P-CM，P-HK，P-WC和P-DZ 4个样品中存在，GenBank登录号分别为MF772328，MF772329，MF772330，MF772331；CMV在所有检测的6个样品P-LD，P-CJ，P-CM，P-HK，P-WC，P-DZ中均存在，GenBank登录号分别为MF772322，MF772323，MF772324，MF772325，MF772326，MF772327；WTGs在P-CJ，P-CM，P-HK和P-WC 4个样品中存在，GenBank登录号分别为MF772318，MF772319，MF772320，MF772321。说明所采集的样品中确实含有PRSV、CMV、CGMMV和WTGs，证实了小RNA深度测序结果的可靠性。

2.4 中国南瓜曲叶病毒海南分离物的全基因组测序分析

经过PCR验证发现，WTGs在4个样品中存在，选取P-CJ样品（昌江）进行DNA-A和DNA-B全序列测定，经扩增、克隆、测序，获得P-CJ DNA-A和DNA-B组分全长分别为2 735 bp（登录号为MF062251）和2 722 bp（登录号为MF062252）。DNA-A病毒链编码AV1和AV2共2个ORF，互补链编码AC1～AC5共5个ORF；DNA-B病毒链和互补链分别编码BV1和BC1 2个ORF，ORF在基因组中的位置及编码的氨基酸数量详见表3。

经Blast检索发现，P-CJ样品DNA-A和DNA-B与SLCCNV分离物的同源性最高，分别在89.2%～99.3%和79.1%～98.8%。为进一步明确P-CJ与NCBI上所有已公布全基因组的SLCCNV的进化关系，基于DNA-A全序列构建了系统关系树（图3），Tomoato pseudo-curly top virus（X84735）为外组，P-CJ与中国、越南、泰国、马拉西亚、东帝汶、菲律宾样品聚集在同一大的分支上，而印度、巴基斯坦的样品聚集在另一分支上。基于DNA-B全序列构建的系统关系树中（图4），Abutilon mosaic Bolivia virus（HM585446）为外组，P-CJ与中国、越南的样品聚集在同一分支上，而印度、巴基斯坦的样品聚集在另一分支上。上述结果说明，从海南昌江南瓜上分离到的WTG是SLCCNV的一个分离物。

3 讨论

病毒病是中国南瓜生产上的一类重要病害，本研究利用小RNA深度测序技术，从6个混合样品建成的cDNA文库池中测得CMV、PRSV、CGMMV和SLCCNV等4种病毒，这些病毒分属4个科，即植物杆状病毒科（Virgaviridae）、马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、双生病毒科（Geminiviridae）和雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）。经PCR验证，除P-LD样品仅检测到CMV存在外，其它5个样品中均检测到2种以上病毒存在，这与重庆、云南和黑龙江等地报道的一致[2-3]，多种病毒同时侵染同一株南瓜，可能是南瓜生产上病毒病害发生严重的主要原因。采用ELISA方法，笔者在2013～2014年采集的180份海南南瓜样本中检测到TMV、CMV和CGMMV等3种病毒[15]。本研究中除检测到CMV和CGMMV外，还检测到PRSV和SLCCNV，但未检测到TMV，可能是由于小RNA深度测序中仅用了6个样品的混合样进行测序，样品量少。考虑到小RNA深度测序的成本，该方法不适合田间大规模病毒种类普查，下一步需要将ELISA、PCR和小RNA深度测序技术三者相结合，研究海南南瓜上各种病毒的侵染时期及其在不同地区的分布情况等。

根据NCBI和相关文献报道，目前中国南瓜曲叶病毒自然寄主有南瓜、甜瓜、西葫芦、黄瓜、苦瓜、冬瓜、佛手瓜等葫芦科作物，主要分布在亚洲的中国（广东、广西、海南）、越南、泰国、马来西亚、菲律宾、东帝汶、印度、巴基斯坦等国家[16-25]。从构建的系统关系树（图3、图4）可以明显看出，SLCCNV明显分为2个大的分支，印度和巴基斯坦的分离物聚集在一个分支上，其它国家的聚集在另外一个分支，海南不同地区的南瓜、甜瓜上的所有分离物均聚集在同一小分支，广东和广西的分离物聚集在另一小分支。说明SLCCNV不同分离物存在明显的地域性分布。

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