结核分枝杆菌的检测技术研究进展

李天宁

DOI：10.19392/j.cnki.16717341.201714220

摘要：结核病是一个全球性公共卫生问题。结核病的病原菌为结核分枝杆菌。可侵犯全身各器官。本文旨在对这些结核杆菌的检测方法和最新进展进行综述，以此来评价结核分枝杆菌检测技术的新进展在结核实验室中的诊断价值。

关键词：结核分枝杆菌；免疫检测；分子生物学检测技术

结核病高死亡率的主要原因是缺乏对结核分枝杆菌快速有效的检测方法。本文现对这些结核杆菌的检测方法和最新进展进行综述，为实验室在检测结核分枝杆菌时提供参考。

1 细菌学检测方法

1.1 抗酸染色

取患者的痰液或組织切片标本，将其中的脓性物质或干酪样物质部分厚涂片，然后进行抗酸染色，在显微镜下观察涂片。一般每100个视野出现1～9条视为阳性。其优点为操作简便易行；缺点是敏感性低，阳性率低。而过氧化氢能够提高细胞壁通透性，使染液易于进入细胞内，因此，可将30%过氧化氢加入碱性品红染液中，有效提高抗酸染色敏感性，增加抗酸染色阳性率。

1.2 金胺O荧光染色

结核杆菌细胞壁具有嗜石炭酸性，可选择在染色剂中加入石炭酸，使其作为媒染剂，促使抗酸杆菌着色。镜下观察，亮绿色荧光表示金胺 O 荧光染色阳性，即为抗酸杆菌。与暗色背景形成鲜明对比。在显微镜下观察涂片，一般每50个视野出现2～18个荧光点则视为阳性。其优点为与暗色背景对比鲜明，不易漏检，但其缺点是由于在暗场中观察，而且荧光强度不断衰减，因此要及时观察，涂片后保存时间较短。近几年来有将发光二极管技术与荧光显微镜相结合，其镜检时间明显缩短，阳性检出率也有所提高。

1.3 噬菌体压电传感器快速检测

利用串联式压电石英传感器对环境电参数相应灵敏的特点，对压电頻移曲线进行分类，用噬菌体成斑率为指标，根据噬菌体只能感染活的结合分枝杆菌的特点，将PAMSPQC法应用于结合分枝杆菌耐药检测。该方法特异性比较好，但是PAMSPQC同样存在噬菌体感染效率的问题。

1.4 结核杆菌培养法

传统的固体培养法以改良罗氏培养基最为常见，其灵敏度高于涂片镜检。随着快速培养概念的提出，半自动和全自动分枝杆菌培养系统迅速涌入市场。随后的BACTECMGIT 960系统保留 BACTEC 460 快速培养的优点得同时以荧光代替放射元素进行检测。

法国生物梅里埃公司研制的BacT/Alert 3D全自动快速结核分枝杆菌培养检测系统，根据培养管中CO2 变化导致的pH 改变，设计可以随着 pH 改变发生颜色改变的传感器进行检测。

2 免疫检测方法

2.1 血清学诊断

血清学诊断常用酶联免疫吸附实验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）的方法。现在常用的结核分枝杆菌抗体包括LAM、38×103与16×1033种抗原的IgG。在最新的研究中，主要将重组抗原应用于ELISA，以提高反应的敏感性和特异性，如包含几个MTB蛋白的融合蛋白（如CFP10、EAST6、MPT64 和 38 kDa 蛋白）。

人群中结核分支杆菌的感染局较高，其中大部分发生是隐性感染，导致在不发病的健康群体内也会存在一定基础滴度的结核分支杆菌抗体，此外各地区健康人群内结核分支杆菌抗体基础水平有较大差异，综上，血清中结核分支杆菌抗体检测虽然具备一定诊断价值，但仍存在局限性。血清学只能作为辅助结核病诊断的指标之一。

2.2 抗酸免疫组化双重染色

在此前的研究中，常应用抗酸和免疫组织化学的方法对组织切片进行染色。但在应用免疫组化的方法同时检测肺结核组织和淋巴结结核组织中结核杆菌的分泌蛋白 （ MPT32、MPT44、MPT46、MPT51、MPT53、MPT59、MPT63 和MPT64） 及菌体蛋白（ Mce1A、Hsp65、MPT57）的实验中发现，不同感染阶段结核杆菌的分泌蛋白的实验结果存在很大差异，因此无法应用于结核病的诊断。此外，结核杆菌菌体蛋白特异性过低，不能较好的反应分枝杆菌与巨噬细胞的准确位置关系，现结核病组织病理学研究时，多应用萋纳氏抗酸染色法和CD68免疫组化双重染色，在同一组织切片中达到同时显示结核分枝杆菌与巨噬细胞分布情况的目的。

采用先免疫组化染色，再抗酸染色，最后苏木素染核的顺序进行操作处理的组织切片，背景清晰、对比鲜明、显色效果好，在同一切片内可以清楚观察到巨噬细胞和结核分枝杆菌的分布状态，便于判定结核病病程性质。

2.3 结核分枝杆菌抗体（IgG）生物微矩阵（芯片）法

利用生物蛋白芯片对结核患者的蛋白制备进行检测，需要将几个蛋白指标进行联合检测，如可将LAM、38 KDa及 16KDa等蛋白联合，有利于结核病阳性蛋白检测的准确率，为结核与肺外结核的早期诊断提供参考。系统包括生物微矩阵（芯片）分析仪与生物微矩阵（芯片），可对生物微矩阵（芯片）的检测信号进行定量分析和结果判定，只需3～5min即可读取数据，特异性好，灵敏度高。

最近20多年來，近年来结核病疫情呈明显上升趋势，现在中国成为全球22个结核病高负担国家之一，全球的流行形势十分严峻。本文通过对这些结核杆菌的检测方法和最新进展进行综述，以此来评价结核分枝杆菌检测技术的新进展在结核实验室中的诊断价值。

参考文献：

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