烟管菌T1原生质体制备及菌丝再生条件优化

高雪艳 储巧玲 周凌峰 韩国民

摘要[目的]研究烟管菌T1（Bjerkandera adusta）原生质体制备及菌丝再生的最佳条件。[方法]研究菌龄、渗透压稳定剂种类和浓度、pH、酶浓度及酶解时间对原生质体得率的影响，并研究再生培养基种类对菌丝再生的影响。[结果]在 PDA 液体培养基中，以28 ℃摇床培养3 d 的菌丝最适于该菌原生质体制备；用0.5 mol/L KCl配制的含有15 mg/mL的溶壁酶于30 ℃下酶解3 h，获得原产量最高，达118×106个/mL；RM1培养基再生率最高，达1.22%。[结论]该研究优化了原生质体制备及菌丝再生条件，为进一步研究烟管菌噬藻分子机制提供理论依据。

关键词烟管菌T1；原生质体制备；菌丝再生；优化

中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0001-02

Abstract[Objective]To study protoplasts preparation and hyphae regeneration conditions of Bjerkandera adusta.[Method] The effect of different culture conditions （hyphae age，stabilizer and stabilizer concentration，pH， enzymatic concenfration，enzymatic hydrolysis time） on protoplasts preparation and hyphae regeneration conditions of Bjerkandera adusta was studied.[Result] The fungal mycelia cultured in the liquid PDA medium at 28 ℃ for 3 days was the most suitable for protoplast preparation.15 mg/mL soluble wall enzyme in 0.5 mol /L KCl hydrolyzing for 4 hours could generate as many as 118×106 protoplasts/mL.The RM1 medium was the preferred regeneration medium on which the regeneration rate was as high as 1.22%.[Conclusion] The study optimize the conditions of protoplasts preparation and regeneration， and provide theory basis for further study of molecular mechanism of Bjerkandera adusta.

Key wordsBjerkandera adusta T1；Protoplast preparation；Hyphae regeneration；Optimization

近年來，水华的暴发越来越频繁，巢湖、太湖、滇池、北美的伊利湖、欧洲的波罗的海、非洲的维多利亚湖等全世界的许多主干水系均曾出现过严重的蓝藻水华[1-3]。水华常释放大量的有毒物质——藻毒素，引起水生和陆生生物中毒，导致人体过敏、致癌、肝受损等，严重影响人类生活。利用真菌菌膜包裹并去除蓝藻是近几年发现的一种新的除藻方式[3-4]。Jia等[5-6]发现真菌冷杉附毛孔菌——1302BG（Trichaptum abietinum）菌丝体将活体藻细胞包裹后并将其完全分解，藻细胞在48 h内完全消失，藻溶液变得澄清透明，并可以在较短时间内（12 h）降解蓝藻毒素。Wang等[7]分离到一株类似除藻模式的真菌Lopharia spadicea，该菌在39 h内可以分解所有藻细胞，再生菌丝体仍具有高效的除藻能力。Han等[8]从紫金山分离得到的约60种真菌中，其中4种真菌Irpex lacteus T2b，Trametes hirsuta T24、Trametes versicolor F21a和Bjerkandera adusta T1除藻效果较好，而真菌Penicillium sp.F02、Hypocrea koningii F50和Aureobasidium pullulans F11等完全不能抑制蓝藻生长。

烟管菌T1（Bjerkandera adusta）是一株消除蓝藻能力较强的真菌，在染料降解及药物污染废水处理中具有潜在应用价值[9- 10]，然而，国内外对此种真菌原生质体制备和再生的研究鲜见报道。为了进一步研究烟管菌噬藻分子机制，笔者以烟管菌T1为对象，从菌龄、酶浓度、酶解时间、渗透压稳定剂的种类和浓度、再生培养基等方面对原生质体制备和再生条件进行优化，获得较优的原生质体制备和菌丝再生条件。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及主要试剂。烟管菌T1分离自南京紫金山[8]，溶壁酶购自广东省微生物研究所。

1.1.2培养基。PDA液体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L；PDA固体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L；PDA再生培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，KCl 0.55 mol/L；RM1再生培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KCl 0.55 mol/L；RM2再生培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏20 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KCl 0.55 mol/L。

1.2方法

1.2.1菌体培养。从保存的试管斜面上挑选菌丝接种于PDA固体培养基上，于28 ℃培养5 d，用接种环取出部分菌丝接种至PDA液体培养基中，28 ℃ 、150 r/min摇动培养。

1.2.2原生质体制备。取摇床培养3 d的真菌菌丝0.2 g，用无菌水洗涤2次，再用0.5 mol/L KCl洗涤2次，转移至0.5 mol/L KCl渗透压稳定剂配制的15 mg/mL溶壁酶中，30 ℃处理4 h，每隔1 h振荡1次，用血球计数板计数。

1.2.3原生质体制备条件优化。摇瓶培养时间为3、4、5、6、7 d的菌丝分别用于制备原生质体；分别选用0.5 mol/L KCl、MgSO4、甘露醇、蔗糖、山梨醇作为渗透压稳定剂进行筛选，得到最佳渗透压稳定剂，在此基础上筛选最适酶浓度、酶解时间及最适pH。

1.2.4原生质体再生培养基的选择。将配制好的原生质体用等渗液稀释至104 个/mL，分别取100 μL涂布在PDA再生培养基、RM1再生培养基、RM2再生培养基3种培养基上，以不含渗透压稳定剂的低渗培养基为对照，28 ℃培养，每组设置3个重复，计算再生率[4]。

X=B-C1A×100%

式中，X为再生率；A为原生质体数量；B为再生菌落数量；C为对照组菌落数量。

2结果与分析

2.1菌龄对原生质体得率的影响在温度28 ℃、pH 6.5、05 mol/L KCl渗透压稳定剂、15 mg/mL溶壁酶的条件下，分别酶解菌龄3、4、5、6、7 d的菌丝进行原生质体制备。由图1A可知，菌龄在3 d时原生质体数量最多，随后原生质体数量明显下降，而在第1天、第2天时由于菌丝体刚刚生长，菌丝量很少，不适合制备原生质体。

2.2渗透压稳定剂种类对原生质体得率的影响在3 d菌龄、其他条件不变的条件下，利用相同浓度的MgSO4、甘露醇、蔗糖、山梨醇分别代替KCl，分析不同种类渗透压稳定剂对原生质体得率的影响。由图1B可知，KCl作为渗透压稳定剂时，原生质体数量最多，山梨醇次之，甘露醇、蔗糖和MgSO4作為渗透压稳定剂时，原生质体数量较少。

2.3渗透压稳定剂浓度对原生质体得率的影响渗透压稳定剂浓度对原生质体得率及原生质体活力具有重要影响。渗透压稳定剂浓度过低时，原生质体容易破裂，而渗透压稳定剂浓度过高时，细胞容易发生质壁分离，且不利于原生质体的释放。由图1C可知，当渗透压稳定剂KCl浓度为0.5 mol/L时最优。

2.4pH对原生质体得率的影响pH也是影响原生质体数量的重要因素之一。由图1D可知，当pH为5.5时，原生质体数量最多，之后随着pH的升高而降低。

2.5酶浓度及酶解时间对原生质体得率的影响由图1E可知，向菌丝中加入10、15、20、30 mg/mL 溶壁酶后，浓度为15、20、30 mg/mL时，原生质体数量无显著差异，但均比10 mg/mL的高。由图1F可知，随着酶解时间的延长，原生质体数量逐渐增多，酶解时间3 h时原生质体数量最多，达118×106 个/mL。随着酶解时间的进一步延长，原生质体数量呈下降趋势。

2.6再生培养基种类对烟管菌T1菌丝再生的影响制备的原生质体在不同再生培养基上经过12～16 h静置培养，可长出细胞壁并萌发菌丝。分别以PDA再生培养基、RM1再生培养基、RM2再生培养基为基础，研究不同再生培养基对烟管菌T1菌丝再生的效果。由图2可知，RM1培养基中再生率最高，达1.22%，RM2培养基次之，PDA再生培养基的再生效果最差。

3结论与讨论

利用真菌菌丝体抑制并消除活体藻细胞是一种新型的真菌-蓝藻相互作用，烟管菌T1是笔者所在课题组前期分离获得的一株具有较强分解能力的抑藻真菌。唐黎等[11]利用烟管菌XX-2处理铜绿微囊藻废水，结果表明，烟管菌XX-2具有抑藻能力。任申荣[12]对烟管菌T1抑藻过程进行转录组分析，获得大量的差异分解酶基因，而制备大量高质量的原生质体是对该真菌抑藻关键基因功能进一步验证的前提和基础。

不同种类微生物细胞壁组成差异较大，因此制备原生质体的最佳条件也有较大差异。不同培养时间的菌丝，其细胞壁组成也有差异，老的菌丝细胞壁上沉积有不易被酶降解的物质，从而大大减少了原生质体的形成和释放，因此生长时间较短的幼嫩菌丝比较适合用于原生质体的制备[13]。烟管菌T1菌龄在3 d时原生质体数量最多，而云芝F21a在4 d时原生质体数量最多[4]。通过对其他参数进一步优化，原生质体产量达1.18×106个/mL，但比云芝F21a及古尼虫草小孢变种原生质体制备效果差[4，13]，而烟管菌T1再生率达122%，略高于云芝 F21a再生率（0.74%），这可能是由于不同菌株遗传背景差异造成的。该试验通过对烟管菌T1原生质体制备和再生条件进行研究，获得了该菌制备和再生的最佳条件，为进一步开展相关基因功能验证奠定基础。

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