两个人工选择奥利亚罗非鱼群体系统发育及其遗传多样性分析

何福玲　凌正宝　肖俊　郭忠宝　钟欢　杨弘　陈文治　唐瞻杨　单丹　梁军能　甘西　罗永巨

摘要：【目的】了解人工選择偏好对奥利亚罗非鱼遗传多样性的影响，为今后人工选育及生产提供参考依据。【方法】对两个奥利亚罗非鱼群体（那马群体和武鸣群体）各70尾个体的线粒体DNA的D-loop区序列、CoI基因和Cytb基因进行测序及系统进化研究，并选用20对微卫星标记对其遗传多样性进行分析。【结果】基于D-loop区序列两个群体共检测出32个单倍型，其中共享单倍型6个；基于CoI基因共检测出23个单倍型，其中共享单倍型16个；基于Cytb基因共检测出14个单倍型，其中共享单倍型10个。基于D-loop区序列、CoI基因和Cytb基因单倍型分别构建的系统发育进化树显示，武鸣群体和那马群体的个体交错在一起，地理差异不明显，且采用NJ法和ME法构建系统发育进化树的进化拓扑结构基本相似。20对微卫星引物均能在奥利亚罗非鱼中获得稳定有效的扩增条带，其中有18个微卫星位点呈多态性；那马、武鸣群体的平均等位基因数（Na）分别为6.5000和7.9444，平均有效等位基因数（Ne）分别是3.9857和4.7268，平均观测杂合度（Ho）分别为0.7123和0.7752，平均期望杂合度（He）分别为0.9614和0.9711、平均Nei期望杂合度分别为0.7017和0.7636，均表现为武鸣群体略高于那马群体。两个群体的遗传分化系数（Fst）在不同微卫星位点间差异明显，其变化范围为0.0173（GM241）～0.2318（UNH868），平均0.0997；从单群体近交系数（Fis）和总群体近交系数（Fit）来看，所有微卫星位点的数值均为负值。【结论】经短期人工选择的武鸣群体奥利亚罗非鱼遗传多样性较被长期人工选择的那马群体遗传多样性丰富，即短期内的不同人工选择偏好对线粒体DNA的遗传影响较小。

关键词： 奥利亚罗非鱼；人工选择；线粒体DNA；微卫星标记；遗传多样性

中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0341-09

Abstract：【Objective】Influences of artificial selection preference on Oreochromis aureus genetic diversity were studied to provide some reference for O. aureus breeding and production. 【Method】Sequence and phylogeny of mitochondrion DNA D-loop region， Cytb gene and COI gene from 140 individuals of two O. aureus populations（70 from Nama population and 70 from Wuming population） were studied. Meanwhile， 20 pairs of microsatellite primers were applied to analyze the genetic diversity. 【Result】Thirty haplotypes were detected based on D-loop region and six of them were shared haplotypes； twenty-three were detected based on CoI gene and sixteen were shared haplotypes； fourteen were detected based on Cytb gene and ten were shared haplotypes. Phylogenetic trees based on D-loop region sequence， CoI gene and Cytb gene indicated that the individuals from Wuming population and Nama population interveined and showed no obvious geographical difference. Evolution topology of phylogenetic trees based on Neighbor-joining（NJ） method and Minimum-evolution（ME）method were similar. All 20 pairs of microsatellite primers could obtain stable and effective amplified bands from O. aureus， and 18 microsatellite loci presented polymorphism. Average allele numbers（Ne） for Nama population and Wuming population were 6.5000 and 7.9444 respectively， average effective allele numbers（Ne） were 3.9857 and 4.7268， average observed heterozygosity（Ho） were 0.7123 and 0.7752， average expected heterozygosity（He） were 0.9614 and 0.9711， average Nei expected heterozygosity were 0.7017 and 0.7636. All the indexes for Wuming population were higher than those of Nama population. There was obvious difference of coefficient of genetic differentiation（Fst） at different microsatellite loci， ranging from 0.0173（GM241）-0.2318（UNH868） with an average of 0.0997. From the perspective of inbreeding coefficient of single group（Fis） and inbreeding coefficient of total groups（Fit）， the values of all microsatellite loci were negative. 【Conclusion】Genetic diversity of Wuming population which was artificially selected for short term is more abundant than that of Nama population which was artificially selected for long time. In another words， influence of artificial selection on mitochondria DNA is small in short term.

Key words： Oreochromis aureus； artificial selection； mitochondria DNA； microsatellite marker； genetic diversity

0 引言

【研究意义】奥尼杂交罗非鱼是以尼罗罗非鱼为母本、奥利亚罗非鱼为父本杂交获得的优良品种，因具有雄性率高、抗寒力强、抗病力好、饵料系数低、耐运输等优点而深受广大养殖户青睐。但由于生产奥尼杂交罗非鱼苗种技术难度和管理要求较高，导致目前国内保存奥利亚罗非鱼种质资源的苗种场较少。广西水产科学研究院于20世纪90年代从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心引进奥利亚罗非鱼，并以尾鳍条纹为主选性状选育至今（保存于广西水产科学研究院那马基地，下称那马群体）。2010年，广西水产科学研究院再次从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心引进奥利亚罗非鱼（保存于广西水产科学研究院武鸣基地，下称武鸣群体）。通过对比这两个群体的遗传差异，了解不同人工选择偏好对群体遗传结构的影响，对今后人工选育及生产实践具有重要意义。【前人研究进展】线粒体DNA因其结构简单、呈母性遗传、进化速度快且不发生重组，作为一种生物遗传标记已广泛用于系统进化研究（Van Goethem et al.，2001）。其中，线粒体D-loop区是线粒体内高度变异的控制区，多态性较高，广泛应用于群体遗传分析（Lai et al.，2005）；Cytb基因进化速度适中，很大程度倾向于转换、颠换，适用于分析种间系统发育差异（Li et al.，2006）；CoI基因相对保守同时有足够的变异，序列长度适宜，且可用通用引物进行扩增和测序，常作为一种可靠的分子标记应用于种属系统进化研究（Matsumoto，2003）。微卫星DNA又被称为短串连重复（Short tandem repeats，STRs），是以少数几个核苷酸（1～6个）为单位组成的串联重复序列，多态性高且呈共显性遗传，被认为是研究群体遗传变异的最佳标记之一，已广泛应用于物种起源进化、遗传多样性分析和动植物遗传育种等研究领域（张涛等，2010）。近年来，越来越多学者将分子标记技术应用到罗非鱼的相关研究中。郭奕惠等（2009）通过分析我国主要养殖罗非鱼的COI基因，探讨了其种间亲缘关系，并证实线粒体COI基因可作为罗非鱼种类鉴别和亲缘关系分析的重要标记；马庆男等（2013）在马来西亚红罗非鱼、奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼、新吉富罗非鱼4群体中建立了TRAP分子标记体系，该体系可用于罗非鱼遗传多样性研究及种类鉴定；李建林等（2015）利用微卫星分子标记分析来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心和广西水产科学研究院两个吉富罗非鱼群体的遗传差异，结果表明，两个吉富罗非鱼群体遗传多样性水平较高，均存在杂合子过剩现象，群体间遗传分化程度中等，具有较强的环境适应能力，且选育空间大。【本研究切入点】至今，鲜见利用线粒体DNA结合微卫星DNA的分子遗传标记技术研究不同奥利亚罗非鱼群体系统发育及其遗传多样性的相关报道。【拟解决的关键问题】基于线粒体D-loop区、Cytb基因和CoI基因测序进行系统进化研究，并通过微卫星DNA技术对两个人工选择奥利亚罗非鱼群体进行遗传多样性分析，旨在了解人工选择偏好对奥利亚罗非鱼遗传多样性的影响，为今后人工选育及生产提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用的两个奥利亚罗非鱼群体（那马群体和武鸣群体）来源一致，均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心以同一祖先群体繁衍获得，但二者选择偏好不同，且分隔之后再无基因交流。分别采集那马群体和武鸣群体奥利亚罗非鱼鳍条（各70尾个体），采集样本分别剪尾鳍于95%乙醇固定，-80 ℃保存备用。

1. 2 奥利亚罗非鱼总DNA提取

奥利亚罗非鱼总DNA的提取采用标准蛋白酶K裂解法（Sambrook et al.，1989）结合Tris饱和酚+氯仿/异戊醇抽提法。

1. 3 线粒体相关片段引物合成

从GenBank中导出奥利亚罗非鱼的线粒体DNA全序列（登录号GU370125.1），利用Primer Premier 5.0设计3对引物（表1）分别用于扩增线粒体D-loop区、Cytb基因和CoI基因，所有引物由上海英潍捷基生物公司合成。

1. 4 PCR扩增及测序分析

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s；5 ℃ 35 s；72 ℃ 50 s，进行35个循环；72 ℃延伸8 min。将PCR扩增产物进行胶回收后送至上海立菲生物技术有限公司测序。

1. 5 线粒体序列相关数据分析

原始测序峰图文件首先利用拼接软件Phred进行处理，使每个碱基的质量值在20以上，然后在默认参数条件下以Phrap进行拼接。拼接结果和碱基质量通过Consed检查，手工去除错误拼接，再用ClustalX对序列进行对位排列，由MEGA 5.0计算序列碱基组成、密码子使用频率和群体间遗传距离，并计算出其变异位点数，最后采用邻接法（Neighbor-joining method，NJ法）、最小进化法（Minimum-evolution method，ME法）分别构建系统进化树。另外，采用DnaSp v5.10计算单倍型数、单倍型间核苷酸差异数、单倍型多样性指数及核苷酸多样性指数。

1. 6 微卫星引物合成

从已发表文献（张庭等，2009；曹祥，2010）查找奥利亚罗非鱼的微卫星引物20对（表2），分别对每对引物的扩增体系和扩增条件进行优化，并委托上海英潍捷基生物工程技术有限公司进行引物合成。

1. 7 微卫星檢测

以20对微卫星引物对两个奥利亚罗非鱼群体的DNA进行PCR扩增，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳进行分离，电泳缓冲液1×TBE，电压280 V，电泳3 h左右。用0.5%冰醋酸固定3 min，2%硝酸银染色5 min，双蒸水漂洗2次（第1次20 s，第2次2 min），0.54%甲醛显影约5 min，最后用预冷的0.5%冰醋酸终止反应。显色后用GD S7500凝胶成像分析系统进行扫描，再以GelWorks1D 3.0对每对微卫星引物扩增获得的DNA分子量进行估算。

1. 8 微卫星数据分析

以电泳凝胶板上的10 bp DNA ladder Marker为参照，然后用Map Gene读取PCR产物的片断大小，记录并录入Excel 2007。使用Microsatellite Analyser（MSA）统计每个微卫星位点的期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）和等位基因数（Na）（Dieringer and Schl-tterer，2003）；并以CERVUS 4.0分析每个微卫星位点（Marshall et al.，1998），了解其多态信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2. 1 线粒体序列分析结果

基于D-loop区序列，那马群体的单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数、平均核苷酸差异数分别为0.795、0.00176和1.640，武鸣群体的分别为0.822、0.00191和1.788；基于COI基因，那马群体的单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数、平均核苷酸差异数分别为0.711、0.00057和0.911，武鸣群体的分别为0.770、0.00075和1.197；基于Cytb基因，那马群体的单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数、平均核苷酸差异数分别为0.494、0.00065和0.739，均低于武鸣群体的0.677、0.00090和1.022。

2. 2 序列单倍型分析结果

基于D-loop区序列对两个奥利亚罗非鱼群体进行单倍型分析，结果表明，从武鸣群体和那马群体的140尾奥利亚罗非鱼中共检测出单倍型32个。其中，共享单倍型6个，占所定义单倍型总数的18.75%。在所有定义的单倍型中，分布最广泛的单倍型是Hap_24，那马群体中有16尾、武鸣群体中有15尾均共用此单倍型。其余的26个单倍型均为独享单倍型，且分布较均匀。

基于CoI基因序列对两个奥利亚罗非鱼群体进行单倍型分析，结果表明，从两个群体的140尾奥利亚罗非鱼中共检测出单倍型23个。其中共享单倍型16个，占所定义单倍型总数的69.57%，其比例远高于基于D-loop区序列得出的结果。分布最广泛的共享单倍型为Hap_1，那马群体中有14尾、武鸣群体中有17尾均共用此单倍型。其余的7个单倍型为独享单倍型，在两个群体中呈不规则分布。

基于Cytb基因序列对两个奥利亚罗非鱼群体进行单倍型分析，结果表明，从两个群体的140尾奥利亚罗非鱼中共检测出单倍型14个。其中，共享单倍型10个，占所定义单倍型总数的71.43%。单倍型Hap_2分布最广泛，那马群体中有20尾、武鸣群体中有25尾均共用此单倍型，在各自群体中出现的比例分别为57.14%和71.43%。

2. 3 单倍型系统发育进化树构建

2. 3. 1 基于D-loop区序列的单倍型系统发育进化树 从GenBank下载萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron）、尼罗罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、鲈鱼（Lateolabrax japonicus）、香鱼（Plecoglossus altivelis）、虹鳟（Oncor-

hynchus mykiss）、鲤鱼（Cyprinus carpio）和斑马鱼（Danio rerio）的D-loop区序列，对应的GenBank登录号详见表3。结合已测得的奥利亚罗非鱼D-loop区序列单倍型，利用MEGA 5.1基于Kimura双参数模型分别应用NJ法和ME法构建系统发育进化树。由图1和图2可知，采用NJ法和ME法构建的奥利亚罗非鱼D-loop区序列单倍型系统发育进化树显示出相似的进化拓扑结构，各单倍型在个体间均匀交错分布，未出现明显的分支。两个群体的个体交错在一起，未体现出差异性，表明群体间遗传距离较近，并出现一定的遗传分化。系统发育进化树均显示，奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼有很近的亲缘关系，与鲤鱼、斑马鱼的亲缘关系较远，即与传统的形态生物学分类一致。

2. 3. 2 基于COI基因的单倍型系统发育进化树 由从图3和图4可看出，两种方法构建的奥利亚罗非鱼COI基因单倍型系统发育进化树显示出相似的进化拓扑结构，各单倍型在个体间均匀交错分布，未出现明显分支。武鸣群体和那马群体的个体交错在一起，地理差异不明显，表明这两个群体间遗传距离很近，并出现一定的遗传分化。两个群体的奥利亚罗非鱼先与尼罗罗非鱼聚为一支，再与萨罗罗非鱼聚为一支，最后才与鲈鱼、香鱼、虹鳟、鲤鱼和斑马鱼聚为一支。该结果与本研究的D-loop区序列单倍型系统发育进化树分析结果一致。

2. 3. 3 基于Cytb基因的单倍型系统发育进化树 由图5和图6可知，基于NJ法和ME法构建的奥利亚罗非鱼Cytb基因单倍型系统发育进化树显示出相似的拓扑结构。各单倍型在个体间均匀交错分布，未出现明显分支。武鸣群体和那马群体的个体交错在一起，地理差异不明显，表明这两个群体间遗传距离很近，并出现一定的遗传分化。两个群体的奥利亚罗非鱼先与萨罗罗非鱼聚为一支，再与尼罗罗非鱼聚为一支，与本研究的D-loop区序列、CoI基因单倍型系统发育进化树分析结果略有不同。

2. 4 PAGE凝胶电泳结果

运用20对微卫星引物对两个奥利亚罗非鱼群体各30尾个体的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经PAGE凝胶电泳，结果表明，20对微卫星引物均能在奥利亚罗非鱼中获得稳定有效的扩增条带。其中，有18个微卫星位点呈多态性，占总数的90%；而微卫星GM542和GM376位点在两个奥利亚罗非鱼群体中表现出单态性，占总数的10%。部分微卫星引物在奥利亚罗非鱼中的PAGE凝胶电泳结果见图7。

2. 5 奥利亚罗非鱼群体位点多态性分析结果

从表4可看出，两个群体的Na存在一定差异，武鸣群体的平均Na（7.9444）明显高于那马群体（6.5000）。在那马群体中，Na最低的是位点UNH868，最高的是位点GM221；在武鸣群体中，Na最低的是位点UNH860和GM603，最高的是位點UNH104。那马、武鸣群体的平均有效等位基因数（Ne）分别是3.9857和4.7268，平均Shannon指数（I）分别为1.4453和1.6777，平均Ho分别为0.7123和0.7752，平均He分别为0.9614和0.9711、平均Nei期望杂合度分别为0.7017和0.7636，均表现为武鸣群体略高于那马群体，但二者间差异不明显，说明两个奥利亚罗非鱼群体间的遗传多态性水平差异并不明显。在PIC方面，那马、武鸣群体的PIC变化范围分别为0.375（UNH868）～0.853（GM221）和0.457（UNH957）～

0.888（UNH995），说明这18个微卫星位点在奥利亚罗非鱼群体中具有较高的多态性。

2. 6 奥利亚罗非鱼群体的遗传分化与基因流

由表5可看出，两个群体的遗传分化系数（Fst）在不同微卫星位点间差异明显，其变化范围为0.0173 （GM241）～0.2318（UNH868），平均0.0997。这表明仅有9.97%的变异存在于群体间，而90.03%的变异存在于群体内，进一步说明奥利亚罗非鱼群体内的遗传变异是其总变异的主要来源。此外，奥利亚罗非鱼群体间的基因流（Nm）变化范围为0.8285（UNH868）～14.1990（GM241），不同位点间的Nm差异明显，群体间的平均Nm为2.2568，数值较高，与奥利亚罗非鱼群体间遗传分化程度较小相一致。而从单群体近交系数（Fis）和总群体近交系数（Fit）来看，所有微卫星位点的数值均为负值，说明这两个奥利亚罗非鱼群体无论是在总体水平还是群体内个体间，均表现出杂合体过剩现象。

3 讨论

3. 1 两个奥利亚罗非鱼群体的D-loop区、CoI基因和Cytb基因比较分析

本研究结果表明，在那马群体线粒体DNA的D-loop区、CoI基因、Cytb基因发现变异位点分别为24、15和12个，在武鸣群体线粒体DNA的对应变异位点分别为25、20和16个，说明线粒体D-loop区序列、CoI基因、Cytb基因均可作为检测奥利亚罗非鱼群体遗传多样性的有效分子标记。核苷酸位点变异主要分为颠换和转换。李娜等（2008）对闽浙地区线粒体Cytb基因和D-loop区序列进行多态性分析，结果在D-loop区序列中检测到5个变异位点，在Cytb基因仅检测到1个变异位点，且所有的变异位点均为转换，未发生颠换。梁宏伟等（2009）对3种中国鲤线粒体DNA D-loop区进行研究，结果在3种中国鲤上共检测到37个变异位点，包含2个插入、28个转换和7个颠换，碱基的替换有明显偏倚。动物线粒体DNA在漫长的进化过程中，发生转换的频率远高于发生颠换的频率。本研究发现的变异位点也是以转换为主，没有颠换发生，符合鱼类线粒体DNA进化的特点。

3. 2 两个奥利亚罗非鱼群体的遗传多样性比较分析

遗传多样性参数主要由单倍型多样度和核苷酸多样度构成，单倍型多样度和核苷酸多样度越高，表明群体的遗传多样性越丰富，变异程度更高（张瑞光等，2010）。本研究根据D-loop区、CoI基因、Cytb基因分析得出的群体遗传多样性结果一致，结果显示武鸣群体的单倍型多样度、核苷酸多样度均高于那马群体，表明武鸣群体的奥利亚罗非鱼遗传多样性更丰富，其群体变异程度更高。生物群体的变异程度与其进化速率呈正比，遗传变异越丰富，群体对环境的适应能力越强，进化潜力就越大（Webster et al.，2003；Makarieva and Gorshkov，2004；Spielman et al.，2004；Garant et al.，2005；Postma and van Noordwijk，2005）。这对遗传育种工作提出了新要求，如何在保持选育效率的同时尽可能地避免遗传多样性降低是今后育种工作的一个重要问题。本研究发现，基于D-loop区序列检测出的遗传多样性参数比基于CoI基因和Cytb基因检测出的遗传多样性参数高，说明D-loop区序列作为反映奥利亚罗非鱼群体遗传多样性的敏感度优于CoI基因和Cytb基因，也进一步证明D-loop区序列变异性更高。

3. 3 两个奥利亚罗非鱼群体的微卫星位点多态性比较分析

从微卫星位点的检测结果可看出，两个奥利亚罗非鱼群体的遗传多样性偏高（Ne=4.3563，Ho=0.7438，He =0.9663，PIC=0.697），略高于宋红梅等（2008）利用尼罗罗非鱼微卫星引物对橙色莫桑比克罗非鱼进行遗传多样性分析的结果。本研究中，武鸣群体的平均Ne、Ho、He均高于那马群体，也说明武鸣群体的奥利亚罗非鱼遗传多样性更丰富。此外，两个群体的遗传分化系数（Fst）在不同微卫星位点间差异明显，其变化范围为0.0173（GM241）～0.2318（UNH868），平均为0.0997，表明仅有9.97%的变异存在于群体间，而90.03%的变异存在于群体内。究其原因，可能是由于武鸣群体的奥利亚罗非鱼引进时间较短，经人工选育的次数较少，其遗传多样性水平更高；而那马群体由于引进时间较长，经过多次人工选育，遗传多样性水平相对较低。李大宇等（2009）通过对黄颡鱼的遗传多样性进行分析，发现高强度的人工选育会使经济性状优良的基因型频率上升并在群体中进一步纯化均一，导致其遗传多样性水平有所降低。因此，如何在保持选育效率的同时尽可能地避免遗传多样性降低是今后育种工作的重点。

4 结论

经短期人工选择的武鸣群体奥利亚罗非鱼遗传多样性较被长期人工选择的那马群体遗传多样性丰富，即短期内的不同人工选择偏好对线粒体DNA的遗传影响较小。

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（責任编辑 兰宗宝）