5种提取方法对甘蔗汁中DNA提取的效果

曾巧英 凌秋平 胡斐

摘要 [目的]研究5种提取方法对甘蔗汁中DNA提取的效果。[方法]以甘蔗种茎中获得的蔗汁为材料，采用2种植物基因组提取试剂盒柱式法和磁珠法、SDS法、CTAB法及简化提取法5种方法提取DNA，对比所提取的DNA浓度、纯度及后续PCR扩增的影响。[结果]以SDS法提取获得的蔗汁DNA浓度最高，平均可达377.50 ng/mL。而柱式法的试剂盒，提取的DNA浓度最低，PCR检测没有能够获得特异的目标条带，不适合用于蔗汁DNA的直接提取。虽然简化法提取的DNA浓度较低，但是能够满足PCR扩增的要求，由于不涉及氯仿等有害物质，操作简单，适用于对DNA质量要求不高时的快速提取。[结论]SDS法最适合用于蔗汁中DNA的提取。

关键词 甘蔗；蔗汁；DNA提取

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）25-0136-03

Abstract [Objective]To study the effects of five methods on total DNA extraction from sugarcane juice.[Method]In this study， five methods， including two kinds of the plant DNA extraction kit （with column and magnetic bead， respectively）， CTAB method， SDS method and simplified DNA extraction method were used to extract DNA from sugarcane juice collected from seedstem， and the quality and quantity of DNA and the following PCR analysis were compared. [Result]SDS method was appropriate for DNA extraction from sugarcane juice and obtained highest amount of DNA from sugarcane juice （377.50 ng/μL， on average）. DNA yield from the plant DNA extraction kit （with column） was lowest and might interfere the following PCR analysis， so this method was not suitable for directly extracting DNA from sugarcane juice. The simplified DNA extraction method had advantage of simple and fast. Although its yield and purity were lower than those extracted by SDS and CTAB methods， it meet the demand of the following PCR analysis and was suitable for fast extraction with lower quality requirement. [Conclusion] SDS method was appropriate for DNA extraction from sugarcane juice.

Key words Sugarcane；Sugarcane juice；DNA extraction

甘蔗是世界重要的糖能兼用作物，地区及各国间的种质交流非常广泛，对甘蔗进行种质鉴定、病害及转基因成分等检测是必不可少的程序。目前，基于PCR的分子标记广泛应用于遗传多样性分析、种质鉴定、转基因、病害检测等方面[1-2]，而开展分子标记检测的基础是获得用于检测的DNA。

研究人员对提取甘蔗DNA开展了大量的研究，这些方法大多数是传统的SDS法、CTAB法及在此基础上的改良提取方法，以甘蔗叶片为主要的研究材料[3-6]。由于甘蔗叶片中含有多酚、多糖等物质，会影响提取DNA的质量及后续PCR，通常用酚、氯仿等试剂去除多酚等物质，传统方法提取步骤较多，比较繁琐。甘蔗主要采用种茎进行繁殖，各地区和国家间的引种也以种茎为主。由于甘蔗萌芽、出苗时间较长，要获得可以提取DNA的葉片需要等待的时间也较长。通过种茎获得少量蔗汁，利用蔗汁提取DNA可以缩短获取DNA的时间。李建勇等[7]发现利用改良的SDS法提取蔗汁中DNA的产率较高，浓度可达235.30 ng/μL，产率虽然低于叶片，但能够满足下游分子试验的要求，而且其操作过程简便。目前有关蔗汁DNA提取方法的研究还很少。该研究以从种茎中获得的蔗汁为材料，对比传统的SDS法、CTAB法、柱式法、磁珠法和简化提取法提取DNA的效率，以期获得最佳的蔗汁DNA提取方法，提高甘蔗分子标记检测的效率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘蔗品种为ROC22，2016 年9 月采自广州甘蔗糖业研究所种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗材料处理。

将甘蔗茎砍成小块，用特制的夹钳榨取蔗汁，取500 μL置于2 mL 的离心管中，每处理各设4次重复。

1.2.2 DNA提取方法。

采用5种DNA提取方法进行蔗汁DNA的提取，分别是2种植物基因组提取试剂盒（柱式法和磁珠法）、SDS法、CTAB法和简化法。

1.2.2.1 柱式法。采用TaKaRa公司的MiniBEST Plant Genomic DNA，按照试剂盒操作步骤进行DNA提取，最后用50 μL的ddH2O洗脱。

1.2.2.2 磁珠法。采用天根的磁珠法植物基因组提取试剂盒，按照试剂盒的操作步骤进行DNA的提取，最后用50 μL的洗脱液将DNA从磁珠上洗脱。

1.2.2.3 SDS法。将500 μL SDS提取缓冲液（含500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L EDTA、2%SDS、0.2% β-巯基乙醇，pH 8.0）加入材料中，65 ℃温浴30 min，期间颠倒混匀，冰上放置10 min，加入80 μL 10 mol/L的NH4AC，4 ℃下12 000 r/min 离心10 min，取上清轉到新的1.5 mL离心管中，加入500 μL氯仿/异戊醇（24∶1）抽取2 次，12 000 r/min 离心10 min。水相加入等体积异丙醇，静置10 min。12 000 r/min 离心10 min，弃上清，75%乙醇洗沉淀2次，沉淀干燥后加50 μL的ddH2O溶解。

1.2.2.4 CTAB法。将500 μL 预热至65 ℃的CTAB 提取液（含1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、3% CTAB、0.2% β-巯基乙醇，pH 8.0）加入材料中，65 ℃温浴30 min，期间颠倒混匀，加入500 μL氯仿/异戊醇（24∶1）抽取2次，12 000 r/min 离心10 min，取上清液转到新的1.5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温沉淀10 min，12 000 r/min 离心10 min，弃上清，75%乙醇洗沉淀2 次。沉淀干燥后加50 μL的ddH2O溶解。

1.2.2.5

简化法。根据Xin等[8]的方法稍作修改进行蔗汁DNA的提取。先加入500 μL的异丙醇，静置10 min，12 000 r/min 离心10 min，弃上清，75%乙醇洗沉淀2 次，干燥5 min。加入100 μL Buffer A（含100 mmol/L NaOH、2% Tween 20），95 ℃温浴10 min，加入100 μL Buffer B（含100 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L EDTA，pH 8.0）混匀静置3 min，12 000 r/min 离心5 min后，取上清。

1.2.3 DNA检测。

1.2.3.1 分光光度计检测。取2.5 μL DNA用ddH2O稀释到100 μL，用Eppendorf的核酸蛋白测定仪（D30）测定所提DNA的A260/A280及浓度。

1.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测。分别取2.5 μL DNA 在1% 琼脂糖凝胶（含50 μg/g的EB替代物，TaKaRa）中电泳分析DNA质量，凝胶成像系统上观察并拍照。

1.2.3.3 PCR检测。以甘蔗的内标基因乙酰乳酸合酶基因（ScALS）和内参基因β-tubulin设计引物进行PCR扩增，引物序列分别为ScALS-F ‘CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG，ScALS-R ‘TGCTGGAATGTTGAACCCTT T[9]；TUB-F ‘CCAAGTTCTGGGAGGTGATCTG，TUB-R ‘TTGTAGTAGACGTTGATGCGCTC[10]。 PCR扩增片段长度分别为171、103 bp。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，LaTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μmol/L，模板2.5 μL。反应程序：预变性94 ℃5 min；94 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统上观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法获得的DNA浓度检测

以无菌水为对照，测定样品A260/A280比值和DNA浓度，5种提取方法获得的A260/A280比值有所不同。其中，以CTAB法提取的DNA质量最好，A260/A280值在1.91～1.96，其次是SDS法，说明这2种方法对酚类物质、色素、盐和小分子物质等杂质去除效果较好；这2种方法获得的DNA浓度也较高，其中SDS法获得的平均浓度为377.50 ng/μL，比CTAB法获得的DNA浓度高了13.96%。柱式法提取的DNA浓度最低，测得的A260/A280不稳定，在1.28～2.94。磁珠法获得的DNA A260/A280在1.37～1.64，浓度高于柱式法获得的DNA浓度。由于简易提取法仅通过碱裂解将DNA从细胞中释放出来，没有经过去蛋白等程序，因此获得的DNA质量最差，A260/A280值在1.17～1.19，虽然获得的浓度值较高，但是受多糖、色素、蛋白等影响，这个测定值并未反映真实的结果。

2.2 不同提取方法获得的DNA凝胶电泳检测

取2.5 μL DNA样品进行凝胶电泳检测，从电泳结果来看，以柱式法和磁珠法提取的DNA由于浓度低，通过凝胶电泳并未见到显著的条带（图1）；SDS和CTAB法提取的DNA条带清晰，无拖尾现象，所得DNA完整性较好；以简易法提取的DNA通过电泳并未见到显著的DNA条带，但是在DNA条带上方有模糊的条带，可能是蛋白多糖等物质。

2.3 不同提取方法获得的DNA后续PCR结果

以根据甘蔗的ScALS基因设计的引物进行PCR扩增，分别取2.5 μL的模板（50 μL体系），分析不同提取方法对后续PCR的影响。扩增产物通过凝胶电泳检测，结果见图2。5种方法中，除了柱式法提取的DNA无法获得明显的扩增条带以外，其他4种方法都可以获得特异性的目的条带，其中SDS法和CTAB法扩增条带高于磁珠法和简单提取法。

以甘蔗内参基因β-tubulin设计的引物进行PCR扩增，除了柱式法提取的DNA无法获得明显的扩增条带以外，其他4种方法均可以获得特异性的目标条带，而且获得的DNA扩增条带亮度差异不大（图3）。由此可见，这5种方法中，除了柱式法以外，其他方法获得DNA均满足下游PCR扩增试验的要求，以SDS和CTAB法提取的质量、产量及后续的分子试验效果优于其他方法，而简单提取法虽然DNA质量不高，但是也可以用于PCR扩增获得特异的目的条带。

3 讨论与结论

目前，植物基因组DNA提取方法主要有基于离心柱表面的树脂或硅胶膜对DNA特异性吸附的柱式法富集DNA，利用磁珠表面官能团吸附DNA的磁珠法，传统的基于碱裂解的SDS法和CTAB法。这几种方法在提取DNA过程中各有优劣[11-13]，利用介质吸附DNA的方法（柱式法和磁珠法），由于不涉及这些有害物质，对环境和人体的伤害较小，而且许多商业化的植物提取试剂盒被开发出来，极大地简化了操作步骤，方便快速，已经开始逐步取代传统的SDS法和CTAB法。磁珠吸附的方法可以用于机械自动化提取，提高DNA提取的效率[14]。

该研究对比了5种不同的DNA提取方法提取蔗汁DNA的效率及其对后续PCR的影响，结果显示柱式法不适宜直接用于蔗汁DNA提取，这可能是由于蔗汁中含有的DNA量较少，而柱式法对DNA提取的效率要低于传统的CTAB法[15]。另外在对果汁、饮料等DNA的提取过程中，往往需要进行预处理，一般是通过直接离心沉淀，或加入异丙醇等后离心沉淀进行富集，再进行DNA提取，这样可以避免水分对裂解的影响[16-17]。该研究中采用的蔗汁没有经过预处理，蔗汁中含有大量的水分，在裂解过程中加入相同量的裂解液时，降低了裂解液中各组分的浓度，使得裂解的效果降低，这也是导致柱式法获得DNA数量较少的原因。尽管磁珠法在提取植物基因组DNA中的效率要高于传统的CTAB法[18]，但是由于存在与柱式法类似的问题，在植物细胞裂解过程中受蔗汁含水量的影响，裂解效率降低，同时磁珠与蛋白结合时也受到影响，导致DNA的提取效率下降。虽然通过电泳无法检测到DNA，但是提取的DNA仍然可以用于进行PCR扩增获得特异性的条带，因此可以直接用于蔗汁中DNA提取。

CTAB法由于可以有效地把植物组织中的多糖沉淀下来，提取的DNA蛋白质和RNA 污染少，纯度较高[11]。研究显示利用CTAB法提取的甘蔗DNA无明显降解，质量较高，比较适合用于RAPD、Southern 杂交分析，因此CTAB法比SDS法更适合从甘蔗叶片提取基因组DNA[19]。在对甘蔗汁DNA的提取中，采用SDS法提取获得的DNA浓度要高于CTAB法，而且两者质量差异不大，由此可见SDS法比较适合用于直接从蔗汁中提取DNA。相对于其他4种方法，简化提取法不涉及酚氯仿等有毒试剂，操作简单，用时较少，而且提取的DNA稳定性比较好[8]。虽然提取液中的DNA实际含量较低，但是基本上满足PCR的要求，适用于大量、快速进行蔗汁DNA的提取。

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