陈念 赵斌 王乾蕾
摘要 食源性病原包括细菌、真菌、病毒、朊病毒和原虫,它们在生产加工及储运环节污染食物,同时不断分泌包含毒素在内的各种成分到细胞外直至自身死亡和裂解,其中一些病原菌及其毒素能耐受复杂的食物加工,直至进入人体干扰细胞生理过程并引发疾病。详细介绍了如何利用各种“组”学(包括蛋白质组、肽组、代谢组和食品组学)技术检测和寻找食源性病原微生物的生物标志物,深入了解其产毒机理、毒力和致病机理,及对胁迫的适应能力。这对于追踪食源性病原微生物内、外毒素的来源,保证食品安全并控制食源性疾病爆发具有重要意义。
关键词 食源性病原;细菌;真菌;毒素;蛋白质组学
中图分类号 TS207 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2017)25-0099-06
Abstract Pathogens from food are mainly bacteria, fungi and some viruses, prions and protozoa, they contaminate food during production, processing, storage and transportation. These microorganisms could secrete many toxins into the extracellular environment. Some bacteria and fungal toxins are resistant to inactivation, and can survive during food preparation. These chemicals are always involved in the pathogenesis. This paper reviews the use of proteomics, peptidomics and metabolomics, in addition to other food omics methods for the detection of pathogenic fungi and bacteria, and their biomarkers. These techniques were useful for discovering the pathogenicity of foodborne pathogens, determining their function mechanisms, and monitoring food safety and prevent the outbreak of foodborne diseases.
Key words Foodborne pathogens;Bacteria;Fungus;Mycotoxins;Proteomics
近年来,随着食品贸易的全球化发展,以及鼓励生鲜、干货和新奇食材等新的营养消费趋势,使得食源性疾病的发生频率显著增加。人食源性疾病主要由食源性病原(细菌、真菌、病毒和寄生虫)及其毒素污染食物所引起,这些疾病极易扩散并引发广泛的公共健康问题[1]。2013年,欧盟共报道了5 196起食源性疾病事件,引起43 183人感染、5 946人住院治疗、11人死亡;代表性的如德法两国近年来频繁发生志贺毒素(Shiga toxin)食源性食物中毒事件。在美国,每年约有940万起食源性疾病事件发生,引起55 961人住院、1 351人死亡。
检测食物病原并保护食物免于腐败变质对于维护公共健康具有重要意义,由于病原通常还能产生致病性毒素,因此只有同时检测病原及其毒素才能保证食物安全。部分食物病原及其毒素具耐热性,常规的食物加工和制备方法很难完全将其破坏,使得食物的安全控制变得更加复杂化[2]。在食物的生产、储存和运输阶段,以蛋白质组、肽组和代谢组为代表的食物组学分析技术已成功用于鉴定食物样品中的食源性病原及其毒素,笔者对近年来相关领域的进展进行了综述。
1 细菌性食物病原及细菌毒素
1.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析细菌特征
一直以来常用的表型鉴定方法(如菌落特征、选择性平板、生化特征、革兰氏染色)因较耗时,而逐渐被效率更高、更准确和可靠的MALDI-TOF-MS方法所取代用于細菌鉴定,后者仅需将细菌菌落引入MALDI平板,用胰蛋白酶消化核糖体或细胞内蛋白,将得到的部分或完整细菌细胞MALDI-TOF-MS肽指纹谱与标准光谱数据库中的数据进行匹配,即能准确鉴定菌种。副结核分枝杆菌亚种(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis,MAP)能感染反刍动物并引起类结核,该耐热菌还易通过牛奶传递给人,过去常用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定牛MAP,但该方法因敏感性较低而难以检测早期感染,还会与环境中的分枝杆菌发生交叉反应。为了满足临床早期、快速、准确检测产毒菌株的要求,以2D凝胶电泳+质谱、MALDI-TOF-MS为代表的蛋白质组方法已经逐渐得到推广应用(表1)。
目前,MALDI-TOF-MS应用于食品检测的技术瓶颈主要在于微生物分离和培养,尤其对于厌氧、生长条件苛刻或生长缓慢的菌株,建议对于此类无法培养或难以培养的毒株,如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica),可针对性地开发相关的样品制备协议。值得一提的是,一方面,某些细菌可能不会对人类健康造成威胁,但其分泌的蛋白可能对人体具有强烈的毒性;另一方面,MALDI-TOF-MS技术仅能检测食物是否染菌,但无法获知毒素编码基因表达或毒素含量相关的信息。
1.2 应用蛋白质组学技术检测细菌毒素
细菌毒素分为内毒素和外毒素,前者为脂多糖,位于G-细菌外膜,细菌生长时很少分泌,但在自溶或受外界因素(如抗生素、宿主免疫噬菌细胞)影响溶菌后则易被释放,因此,其通常在细菌生长后期作用,中等毒性且对热稳定;后者为G+或G-细菌分泌的蛋白(某些外毒素仅当细菌裂解时才释放),常通过酶促反应起作用,威胁和特异性均强于前者,而且可在远离细菌生长的位置远程发挥作用。2013年,欧洲有约16%的食源性事件都是由主要来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌外毒素所引起的。
1.2.1 不依赖凝胶的蛋白质组学方法。
葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SE)是金黄色葡萄球菌产生的耐胃肠道蛋白酶解的外毒素,耐热、酸和pH变化,加工过程中较稳定,分23种血清型,其中SEA和SEB引起的葡萄球菌食源性疾病各占80%和10%。卫生条件是SE污染食物的主要原因,目前SE检测主要采用免疫亲和技术,也有使用MALDI-TOF-MS,前者要求提前制备肠毒素特异性抗体(目前仅可获得SE A-E、G、H和Q),技术流程复杂且成本高昂,制备的抗体还常与肠毒素性质相似的分子发生交叉反应。一种无需标记的同位素稀释LC ESI MS/MS方法被用于检测牛奶和虾中的SEA和SEB,检测限达2.5 ng/g(SEA)和5.0 ng/g(SEB)。Sospedra等[6]使用单级三重四极质谱代替串联质谱检测牛奶和果汁中的SEA和SEB,可能由于样品制备误差使检测限减少了一个数量级。Dupre等[9]用同样的方法定量人体液和食物中的SEB、蓖麻毒素(Ricin)和内毒素(ETX),检测限低至1 ng/mL。
食物中多数外溢蛋白(exo proteins)能耐热加工处理,但部分肉毒杆菌(C.botulinum)株系产生的致死性极强的肉毒菌神经毒素(Botulinum neurotoxin,BoNT,自身具蛋白水解酶活性)则极易受热变性。一直以来,小鼠活体注射生物分析法被作为BoNT定量检测的金标准,但存在误差大、成本高和伦理学等缺点;免疫学方法(如ELISA)敏感性高,但易发生交叉反应或假阳性。内肽酶活力分析法(Endopeptidase activity assays)基于BoNT固有的水解酶活性,偶联质谱仪与反应室可快速检测底物分裂位置,被用于鉴定血清型。Kuklenyik等使用MALDI-TOF-MS、HPLC-ESI-MS/MS和内肽酶活力分析法对具酶催化活性的炭疽病致死因子定量测定的效果进行了比较,其中同位素稀释MALDI-TOF-MS方法更快、更准确可靠。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种产芽孢的G+细菌,污染面粉、面包和酵母且耐烘烤,萌发的孢子能引起面包变质,结合无标记定量LC-MS-MS和生物信息学分析,对生长受抑制情况下枯草芽孢杆菌的蛋白质组变化进行研究,检测到的差异表达的蛋白主要为涉及蛋白质合成和能量代谢的酶和辅因子,以及包含热激蛋白在内的分子伴侣;结合2DE、DIGE和iTRAQ分析,使用多元定量方法对抗微生物剂桃拓酚(Totarol)处理后枯草芽孢杆菌的变化进行分析,共鉴定了139种差异表达的蛋白,其中涉及中心代谢、无氧呼吸、亚铁血红素生物合成及细胞内环境稳定的关键酶的表达均显著下调。利用LC-MS对艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile,可形成孢子的G+细菌,能感染人结肠引起腹泻)的分泌蛋白质组(Secretomes)进行研究,在上清液中鉴定了158种蛋白。Ternan等使用LC-MS基于“指数改良的蛋白质丰度指数(exponentially modified protein abundance index,emPAI)”光谱计数方法测定了热胁迫(从37 ℃提高到41 ℃)响应下的蛋白质组变化,有65个蛋白(37%)变化程度超过1.5倍,41 ℃时运动相关的鞭毛丝蛋白表达减少了2.7倍。
沙门氏菌属的沙门氏肠菌(Salmonella enteritis)和S.bongori是重要的全球性食源性病原,前者为细胞内病原,在宿主细胞内的膜结合区——沙门氏菌囊泡(Salmonella containing vacuoles,SCVs)进行复制。伤寒沙门杆菌(S.typhi)及其他非伤寒血清型可分泌伤寒毒素(Typhoid toxin),该细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)由CdtB(DNaseI样催化活性)、PltA(ADP核糖基化活性)和PltB 3个亚基组成(Plt对于CdtB的分泌是必需的),通过结合含N-乙酰神经氨酸末端的多糖链的细胞而产生毒性。产志贺毒素的E.coli O104∶H4可能对人造成致命伤害,而其他无毒的大肠杆菌菌株则常被作为工业或模式微生物,相关的蛋白质组已进行了大量研究,如不同生长阶段蛋白质改变以及各种抗微生物试剂对它们的影响。单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,G+)是食物加工的主要污染菌,适应温度范围广,其毒性主要来自李斯特菌溶血素(Listeriolysin O,外毒素),抑制剂对其蛋白质组的影响已使用LC-MS/MS和定量无标记LC-MS/MS进行了研究。细菌小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica,G-)及其肠道毒素Yst感染主要来自生的水果和蔬菜,耐低温冷藏,可引起小肠结肠炎。弯曲菌属(Campylobacter)的空腸弯曲杆菌(C.jejuni)常引起人急性感染性痢疾,其发病率甚至超过沙门氏菌属,与其他细菌不同,空肠弯曲杆菌兼具N-连接和O-连接2个糖基化系统,其糖蛋白含有细菌特异性的单糖“Pseudaminic acid(一种类似唾液酸的糖衍生物)”和“Diacetamidobacillosamine”,这对于其特异性检测非常重要。
1.2.2 基于凝胶的蛋白质组学方法。
分泌蛋白质组研究有助于阐明细菌中各种蛋白组分的致病机理,为了富集低丰度蛋白,常首先利用LC或凝胶电泳等方法对完整的蛋白质组进行预分级。以牛奶蛋白为例,蛋白混合物经SDS-PAGE分离后,将切割下来的电泳条带用胰蛋白酶消化后提取并测定SEA,鉴定了19种标准SEA胰蛋白酶水解肽(序列盖度73%)。Enany等[24]用SDS-PAGE和强阳离子交换树脂对甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,MRSA)的分泌蛋白质组进行预分级后再用串联质谱分析,鉴定了174种蛋白,随后又结合SDS-PAGE和LC-MS/MS对MRSA和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的分泌蛋白质组进行比较研究,分别鉴定了261种(MRSA)和168种(MSSA)细胞外蛋白,其中144种由MRSA独有,其中极可能含有该菌株的毒力因子。Quiblier等[25]用LC-MS/MS对分泌途径辅助蛋白SecDF研究发现,secDF缺失在引起胞外蛋白质组(exoproteome)变化的同时,金黄色葡萄球菌对宿主细胞的吸附、入侵和毒性也同时下降。使用SDS-PAGE预分级组合“LTQ Orbitrap XL”质谱仪对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)secDF敲除突变体的分泌蛋白质组进行研究,也发现同样的变化,突变体分泌蛋白质组中3种最常见的痢疾肠道毒素水平均低于野生型。蜡样芽孢杆菌天然生长于低氧的小肠环境,对其在3种不同培养条件下(低氧化还原电势-Oxireduction potenial/ORP + 缺氧、高ORP + 缺氧、有氧)的分泌蛋白质组进行比较,共鉴定了57种分泌性毒力相关蛋白(其中新发现31种)。
利用2D凝胶电泳偶联MALDI-TOF/TOF对产气荚膜梭菌(C.perfringens)A、C型菌株的胞外蛋白质进行比较,发现了一些在其他G+细菌胞外蛋白质组中从未报道过的蛋白,SagA蛋白、DnaK型分子分子伴侣hsp70、內β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作为分泌丰度最高的蛋白,可作为食物样品中产气荚膜梭菌的检测标记(进化保守且与最近相似蛋白同源性低至≤50%)。
2 真菌性食物病原与真菌毒素
在真核食物病原中,产毒微藻的毒力最强但食用较少,毒力相对较弱的食源性病原真菌与细菌一起共同构成食物变质最常见的原因。病原性真菌主要来自青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)等丝状真菌,由于栽培、加工或储藏不当等因素,其感染可食用植物和饲料后合成真菌毒素,并通过食物链继续传递给动物或人。
Braaksma等[26]结合SDS-PAGE与LC-MS/MS,鉴定了黑曲霉(A.niger)生长相关联的分泌蛋白质组;Ji等[27]用凝胶电泳与Q TOF分析了禾谷镰刀菌(F.graminearum)分泌蛋白质组,鉴定了87种蛋白(其中63种与生物信息学预测结果一致)。一种类似SDS-PAGE升级版的“Blue Native(BN)-PAGE”技术被用于鉴定哈茨木霉(Trichoderma harzianum)分泌蛋白质组;同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)被用于定量烟曲霉菌(A.fumigatus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)和里氏木霉(Trichoderma reesei)的分泌蛋白质组;将稳定同位素加入生长培养基中的代谢标记方法也较常用,如氨基酸同位素标记(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)被用于研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)蛋白质组[28];除了化学标记和代谢标记外,还有一种无标记的MS方法也被用于定量研究嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)和豌豆锈病菌(Uromyces appendiculatus)的分泌蛋白质组,两者分别采用了基于emPAI和“归一化光谱丰度因子(Normalized spectra abundance factor,NSAF)”的不同的光谱计数方法。
控制真菌毒素风险最可靠的方法是防止真菌生长,消除肉眼可见的真菌不代表就没有真菌毒素,许多真菌毒素能抵抗复杂的食品加工过程并长时间存留于食物中,因此,检测真菌毒素比检测分泌毒素的真菌更为重要。近年来有关利用蛋白质组技术检测食物中常见真菌毒素的报道参见表2。
目前,全球已鉴定了≥400种真菌毒素,其中研究最多也是最常见的来自食源性真菌的低分子量毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉素,以及包含伏马菌素(Fumonisins)、玉米烯酮(Zearalenone,ZEN)、单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)在内的镰刀菌真菌毒素。天然环境中真菌毒素最主要的功能是抑制和杀灭周围的竞争性微生物,这些次生代谢物即使在低浓度对于动物和人也常具有毒性,表现为细胞毒性、致癌或致畸变,可引起严重的健康问题。许多真菌毒素都是耐热的,因此很难完全控制其污染,常见的方法有抑制真菌生长、食品净化和脱毒,此外,加入胃肠道真菌毒素结合剂(减少其生物利用度)或添加有益的肠道细菌(使毒素在吸收前即降解或酶法转化为低毒化合物),也是值得推荐的控制真菌毒素危害的方法。
2.1 待检样品的制备
检测食物中真菌毒素的第1步是选取和制备样品。正确的清洁样品对于获得准确、可靠的试验数据非常重要,尤其对于极低浓度的目标化合物。“Dilute & Shoot”是最简单的制备真菌毒素待检样品的方法,即将样品稀释后不经过滤清洁直接注射入LC。固相萃取(Solid phase extraction,SPE)是最常用的预浓缩真菌毒素样品的方法。Campone等[32]使用加压溶剂提取和在线 SPE提取偶联UHPLC-MS/MS全自动检测干燥水果中的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A(OTA)。Tolgyesi等[44]使用聚合物柱SPE结合LC-MS/MS对小麦、番茄汁和太阳花种子中的链格孢属(Alternaria)毒素进行分离和定量,包括交链孢霉烯(Altenuene)、链格孢毒素(Tentoxin)和细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)等,定量范围达1~10 μg/kg,但该方法存在耗时、耗费大量有机溶剂且成本高等缺点。采用SPE方法时,固定相的吸附作用会造成样品损失,且固相与样品间的相互作用还受pH和溶剂类型等因素的影响,基于SPE升级而来的固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)技术使溶剂用量减少至几毫克,该方法已用于坚果、小麦、玉米和谷物中OTA和OTB的测定。
分散液液微提取(Dispersive liquid liquid micro extract,DLLME)和QuEChERS——“Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe”是2种较新出现的提取方法,适合同时分析多种真菌毒素:①DLLME升级自液液提取(Liquid liquid extraction,LLE)技术,该技术简单、高效,且溶剂消耗量远低于后者;DLLME偶联LC MS/MS被用于测定水样中的6种雌激素、玉米中的ZEN,以及稻米中的黄曲霉毒素(AFB)和OTA。②QuEChERS方法制备样品仅需“三步”——加入溶剂、用盐将水隔开、使用分散SPE清洗;QuEChERS偶联LC-MS/MS已成功用于多种真菌毒素的同时检测,如鸡蛋(ZEN、DON、AFB1及其代谢物)和酒(36种真菌毒素)[47]。
2.2 免疫化学与色谱检测方法
免疫化学与色谱是2类最常用的真菌毒素检测方法,其中免疫化学方法以表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)和ELISA为代表,两者均依赖于针对真菌毒素的特异性抗体:①SPR生物传感器[48]。将分子印迹聚合物通过单链的DNA或RNA寡聚核苷酸适配体固定在SPR芯片表面,可检测DON、红曲米中的橘霉素;Zhu等[49]将OTA靶向适配体经生物素与固定于传感器芯片表面的链霉亲和素交联,定量检测酒和花生油中的OTA。②ELISA[50]。基于单克隆抗体的间接竞争性ELISA(IC ELISA)技术被用于定量检测玉米青贮饲料中的蕈青霉素(Paxilline)和OTA、稻米稻曲球和水稻籽粒中的稻曲毒素(Ustilotoxin B)。③其他。如免疫亲和柱偶联荧光光度计测定肉制品中的真菌毒素;荧光极化免疫分析(Fluorescence polarization immunoassay)快速筛选啤酒中的黄曲霉毒素B1。
无论是单克隆抗体、适配体还是免疫亲和柱,均依赖于真菌毒素与其特异性配体之间特异性的相互作用,这也使得免疫化学方法主要适于单个真菌毒素的检测,而对于含多种真菌毒素的复杂样品,则推荐使用色谱方法。最常用的色谱学方法是LC偶联MS或随机MS/MS。Serrano等[51]使用LC ESI MS/MS技术对65份稻米样品中的镰刀菌真菌毒素白僵菌素(Beauvericin,BEA)、恩镰孢菌素(Enniatins,ENNs,分A、A1、B、B1 4种组分)、Fusaproliferin和串珠镰刀菌素(Moniliformin)进行了分析,在26份样品中均检测含有BEA,ENNs仅检测到了A1组分,后两者未检测到。Escriva等[40]使用GC-MS/MS从鼠饲料中检测到了7种单端孢霉烯族毒素,其中DON存在最普遍,然而,因为真菌毒素是极性化合物,使用GC分析需额外增加衍生化步骤,所以已逐渐被LC所取代。
在食品安全评价领域,随着MS离子化技术“MALDI-TOF和ESI-MS”的不断发展,以轨道阱质谱仪为代表的高分辨率质谱(High resolution mass spectrometers,HRMS,分辨率可高达1万、质量准确度≤5 mg/kg)将逐渐成为检测食物中真菌毒素的首选方法。Dominicis等[52]使用UHPLC结合单级轨道阱定量测定了牛奶和小麦粉中的33种真菌毒素、杀虫剂和抗生素;同样的方法还成功测定了谷类中的T2和HT2毒素及其糖基化衍生物,以及玉米中的伏马菌素。在定量检测方面,建议选择同位素稀释(Isotope dilution,ID)LC-MS作为内标(其基于信号比代替信号强度),该方法已被用于检测自制豆瓣酱中的OTA、苹果中的棒曲霉素,甚至人尿液中的TeA。
3 小结与展望
以蛋白质组、肽组、代谢组为代表的各种食物组学技术,为更有效地监控食品生产、运输和存储过程中食源性病原及其毒素的污染提供了强大的技术手段。高通量样品制备方法及MALDI-TOF-MS技术的发展将进一步促进这些技术在常规食品样品分析中的使用。随着轨道阱和傅里叶变换离子回旋MS技术的发展,超高分辨率质谱(Ultra high resolution mass spectrometry,UHRMS)的分辨能力将实现超过10万级别,并进一步促进LC-MS-MS在毒素分析与鉴定疾病生物标记物中的广泛应用。
当然,传统的以免疫化学为代表的微生物及其毒素检测方法,在常规使用中依然存在巨大的潜力可供挖掘,尤其是小型化和新的高通量技术的应用,将进一步降低检测限、减少样品和溶剂用量,同时显著缩短分析时间[53]。值得一提的是,对于真菌毒素,除了致病威胁外,某些还具有利用价值,如麦角菌属真菌产生的麦角生物碱可作为医药原料生产抗偏头痛药物、催乳激素(Prolactin)抑制剂或抗帕金森病药物,这些方向都值得进一步深入研究。
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