黄芪甲基化敏感扩增多态性（MSAP）扩增引物筛选及初步应用

宗凯 赵营莉 周莉质 李秀秀 宫鹏 夏泉

摘要 [目的]建立并优化黄芪甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术扩增反应体系，对中药材黄芪甲基化水平进行研究。[方法]磁珠法提取黄芪DNA后，采用Hpa II/Msp I 2种内切酶进行酶切，将酶切产物加上连接接头序列，经预扩增和选择性扩增反应，最终从黄芪 MSAP的256对引物中筛选出最佳分辨引物4对。应用筛选到的4对引物，分析12种不同产地黄芪的甲基化模式，并对甲基化水平聚类分析。[结果]经MSAP检测12个黄芪样本半甲基化率在12.5%～26.7%，全甲基化率在25.6%～51.1%，总甲基化率在48.7%～735%，总体上黄芪样本的全甲基化率大于半甲基化率。采用NTSYSpc软件对黄芪样品Hpa II和Msp I多态性数据进行分析，获得UPGMA聚类图和主成分分析PCA图。[结论]MSAP技术能够很好地用于黄芪的甲基化分析，结合NTSYSpc软件能对不同产地黄芪之间甲基化水平进行聚类分析，且初步分析结果表明从UPGMA和PCA图上来看，地区相近的单株聚类分析表现出了一定的地域性。

关键词 黄芪；甲基化敏感扩增多态性；选择性扩增；聚类分析

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）29-0149-04

Primer Screening and Preliminary Application of MSAP for Radix astragali

ZONG Kai1，ZHAO Yingli2，ZHOU Lizhi1，XIA Quan2* et al

（1.Anhui EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Hefei，Anhui 230022；2.The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei，Anhui 230022）

Abstract [Objective] To establish and optimize the amplification system of methylation sensitive polymorphism （MSAP） to study the methylation level of Radix astragali. [Method] DNA of Radix astragali was extracted by magnetic bead method and digested with HpaII/MspI endonuclease. The digested products were connected with the linker sequence， and then preamplification and selectively amplification were carried out. Four pairs of primers were screened out from the 256 pairs of primers of MSAP， and were used to analyze the methylation levels for 12 different habitat samples of R. astragali. [Result] For 12 samples， the rate of half methylation and full methylation were 12.5%-26.7% and 256%-51.1%， respectively. The total methylation rate was 48.7%-73.5%. The UPGMA clustering and principal component analyses （PCA） were obtained by analyzing the HpaII and MspI polymorphism data with NTSYSpc software. [Conclusion] MSAP technology can be used for the methylation analysis of R.astragali. The preliminary analysis of cluster analysis showed some regional characteristics of R. astragali from the UPGMA and PCA plots.

Key words Radix astragali；MSAP；Electively amplification；Cluster analysis

基金項目 国家质检总局科技计划项目（2015IK001）。

作者简介 宗凯（1985— ），男，安徽合肥人，工程师，硕士，从事中药材质量安全研究。

*通讯作者，主任药师，副教授，博士，从事中药材质量评价研究。

收稿日期 2017-07-26

黄芪（Radix astragali）为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.var.mongholicus（Bge）Hsiao]或膜荚黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.]的干燥根[1]。黄芪属于传统的补虚药，其化学成分主要为多糖类、皂苷类、黄酮类、氨基酸及微量元素等，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗衰老、保肝、增强心肌收缩力和利尿等作用，被广泛用于养生保健及相关疾病的临床治疗[2]。蒙古黄芪主产于内蒙古、山西、甘肅和黑龙江，膜荚黄芪主要分布于我国东北、华北、甘肃、四川、西藏等省区，其化学成分存在显著差异[3]。

DNA甲基化（DNA methylation）是表观遗传学的一种重要修饰形式，已有大量研究证实其在植物的基因表达、生长发育过程中起着重要作用，进而影响植物化学成分的变化[4]。

DNA甲基化水平分析是研究表观遗传学的重要内容，目前分析植物基因组总甲基化水平主要有甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）、高效液相色譜法、5-甲基胞嘧啶免疫学抗体技术、SssI甲基转移酶分析、氯乙醛反应法等[5]。MSAP技术是由Reyna-López等[6]首次提出，并成功用于检测真菌的DNA甲基化。后来MSAP技术开始应用于多种植物甲基化水平的检测，涉及植物抗逆性研究、发育调控与基因差异表达、种质资源鉴定、组织培养材料的鉴定等方面[7]；在中药的资源研究方面，MSAP技术也得到广泛的应用，如白术、川牛膝、丹参和广藿香等[8-11]，但目前国内对黄芪基因组甲基化方面的研究还较少[12]。该研究以黄芪为材料，利用MSAP技术筛选合适的扩增引物，分析12组不同产地黄芪和对照药材的甲基化水平，初步建立MSAP技术分析黄芪DNA甲基化的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芪药材10个，经河北省邯郸市药品检验所孔增科教授鉴定为蒙古黄芪和膜荚黄芪，用前粉碎并过80目筛；黄芪对照药材2个，购自中国食品药品检定研究院，分别为蒙古黄芪和膜荚黄芪（表1）。

Hpa II内切酶（ER0511）、Msp I内切酶（1ER0541）、EcoR I内切酶（ER0271）和T4连接酶（EL0014）均购自Thermo公司。2×Taq PCR Master Mix（kt201）和DL2000 Maker（md114）均购自天根生化公司。引物和接头由南京金斯瑞科技服务有限公司合成。磁珠提取试剂盒：ME1裂解缓冲液（20160530），ME2吸附缓冲液（20160530），ME3磁珠（20160607），ME4洗涤缓冲液（20160530）。

1.2 仪器与设备

5424小型高速离心机（Eppendorf公司）；Nanodrop 2000核酸蛋白分析仪（Thermo公司）；veriti梯度PCR仪（ABI公司）；全自动DNA/RNA分析系统QIAxcel（QIAGEN公司）；全自动DNA磁珠提取仪（Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取。

按照磁珠提取试剂盒的方法 对黄芪基因组DNA进行提取，用Nanodrop 2000核酸蛋白分析仪进行纯度和浓度测定。

1.3.2 酶切反应。

10 μL体系包括50～100 ng DNA、1.5 μL EcoR I、1.5 μL Hpa Ⅱ/Msp I、2 μL Buffer，ddH2O补至10 μL。37 ℃酶切6 h，80 ℃灭活15 min，取酶切产物上QIAxcel电泳检测。

1.3.3 连接反应。

连接接头引物和反应体系、条件参考文献[13]。

1.3.4 预扩增反应体系。

10 μL体系包括1 μL连接产物、5 μL 2×Taq PCR Master Mix、上下游预扩增引物各1 μL，剩下用ddH2O补至10 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s（30个循环）；72 ℃ 5 min，25 ℃ 3 min，预扩增产物上QIAxcel电泳检测。

1.3.5 选择性扩增反应体系与引物筛选。

将预扩增产物稀释50倍作为模板，10 μL体系与预扩增体系相似。选择性扩增的PCR程序采用Touchdown PCR：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（13个循环，每个循环退火温度下降0.7 ℃）；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min（22个循环）；72 ℃ 5 min，25 ℃ 2 min，选择性扩增产物上QIAxcel电泳检测。

按照16×16共组合成256对引物进行筛选，引物序列参考文献[13]。用QIAxcel电泳检测引物筛选情况，将条带丰富、图谱清晰、多态性高的引物对保留。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取和酶切结果

试验采用磁珠法提取出黄芪基因组DNA，经Nanodrop 2000核酸蛋白分析仪测定其OD260/OD280值均在1.7～2.1，纯度和浓度均满足后续MSAP试验要求。采用10 μL酶切体系，在37 ℃恒温酶切6 h后经电泳检测，结果显示酶切完全，可进行下一步连接反应。

2.2 预扩增和选择性扩增引物筛选

优化预扩增反应体系后，将预扩增产物稀释50倍，取1 μL作为选择性扩增反应的模板，采用10 μL体系进行选择性扩增。选择性扩增采用EcoRI引物16组（E1～E16）和Hpa II /Msp I引物16组（HM1～HM16），共组合成256对引物进行筛选，引物序列参考文献[13]。

以7号黄芪样品作为引物筛选模板，对256对引物组合进行筛选，在100～800 bp选择扩增条带致密、多态性高的引物组合。从256对引物组合中，综合比较了Hpa II和Msp I引物筛选电泳图，筛选出4对条带丰富且清晰的引物组合（H1E16、H3E7、H5E4、H5E15），对12组黄芪样品进行MSAP检测（图1）。

2.3 甲基化水平分析

通过 MSAP分析，12组黄芪样品的半甲基化率在12.5%～26.7%，全甲基化率在25.6%～511%，而总甲基化率在48.7%～73.5%。总体上黄芪样本的全甲基化率大于半甲基化率，其中2號黄芪全甲基化率是半甲基化率的4倍，5号、7号和11号黄芪全甲基化率是半甲基化率的2倍多（表2）。

2.4 UPGMA聚类和主成分PCA分析

将黄芪样品甲基化敏感多态性和甲基化不敏感多态性产生的0和1矩阵保存在Excel表中，采用NTSYSpc软件进行聚类分析，得到12组黄芪样品聚类分析图（图2）。图2A和图2B分别是采用2种内切酶Hpa II和Msp I分析后获得的结果。从图2A可以看出，当相似系数为0.77时，12组黄芪样品可以分为4类，即1号和12号为第1类；2号、3号、5～9号、11号共8组样品为第2类，这类包含样品数最多，它们之间有较近的亲缘关系；10号和4号样品分别为第3和第4类。从图2B可以看出，当相似系数为0.80时，12组黄芪样品可以分为7类；当相似系数调整为0.75时，12组黄芪样品可以分为4类，即1号、2号和12号为第1类；5～10号共6组样品为第2类；3号、11号为第3类；4号为第4类。从产地来源上看，Hpa Ⅱ和Msp I多态性数据UPGMA图的5～9号样品划为同一类，而5～9号样品均产自甘肃地区，可见聚类分析表现出一定的地域性特点。

使用NTSYSpc软件分别对Hpa Ⅱ 和Msp I 2种酶酶切获得的数据进行主成分分析，观察不同黄芪样品在多维空间的分布状态，结果见图3。图3A显示，5～9号为一个很近群体，表明有很近的亲缘关系，与聚类分析结果相似。图3B中5～10号共6组样品为一个群体，也与上述聚类分析一致。从图3A和图3B中可以看出，第一维度的贡献率均大于第二维度贡献率。与聚类分析类似，5～9号样品在Hpa Ⅱ 和Msp I获得主成分分析PCA图上都表现了一定程度的地域性特点。

3 结论与讨论

3.1 引物筛选的原则是条带多、清晰、多态性高

选择性扩增采用EcoR I引物16组和 Hpa Ⅱ/Msp I引物16组，共组合成256对引物进行筛选，筛选工作量比较大，因此采用QIAxcel分析系统，其能自動获得电泳结果，与普通做胶琼脂糖电泳相比具有全自动、高通量和电泳图谱清晰等诸多优点；QIAxcel分析系统在获得高质量的电泳图谱同时，能自动对扩增条带进行分析，使用标准Marker后能对每一条带进行大小和浓度确定，特别是能够区分条带差异小的带型。该研究通过比较后选择了4对条带丰富且清晰的引物组合（H1E16、H3E7、H5E4和H5E15），对12组黄芪样品进行MSAP检测和分析。

3.2 不同单株黄芪的聚类分析和主成分分析

采用NTSYSpc软件分别对EcoR I/Hpa Ⅱ 和EcoR I/Msp I组合获得的多态性数据进行UPGMA聚类分析和PCA主成分分析，2种分析结果类似。来自不同地区的黄芪样品，DNA甲基化水平和模式存在差异，但从UPGMA和PCA图上来看地区相近的单株，比如产地为甘肃黄芪有着较近的聚类，表现出一定程度上的地域性特点。

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