正交试验优化罗布麻茎中总黄酮的提取工艺

杨永涛　潘思源　田英姿 韦世鹏

摘要 [目的]优化罗布麻茎中总黄酮的提取工艺。[方法]采用乙醇浸提法从罗布麻茎中提取总黄酮。在单因素试验基础上，采用正交试验对罗布麻茎中总黄酮的提取工艺进行优化。[结果]罗布麻茎中总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度50%、提取温度50 ℃、提取时间1.5 h、料液比1 ∶40（g ∶mL）、樣品目数100，此条件下的提取率达2.033%。[结论]该研究为罗布麻的开发利用奠定基础。

关键词 罗布麻茎；总黄酮；提取工艺；正交试验

中图分类号 R284.2 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2017）29-0114-03

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Stems of Apocynum venetum L.by Orthogonal Experiment

YANG Yongtao，PAN Siyuan，TIAN Yingzi* et al

（Institute of Light Industry Science and Engineering，South China Unversity of Technology，Guangzhou，Guangdong 510640）

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the extraction technology of total flavonoids from Apocynum venetum stems.[Method]Total flavonoids from Apocynum venetum stems were extracted by ethanol extraction.On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment was used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Apocynum venetum stems.[Result]The optimum extraction technology of total flavonoids from Apocynum venetum stems were ethanol concentration 50%，extraction temperature 50 ℃，extraction time 1.5 h，solidliquid rate 1 ∶40 （g ∶mL），sample number 100，the extraction rate under this condition was 2.033%.[Conclusion]The study laid the foundation for the development and utilization of Apocynum venetum.

Key words Stems of Apocynum venetum L.；Total flavonoids；Extraction technology；Orthogonal experiment

基金项目 广东中烟工业有限责任公司科技项目（粤烟工05XM-QK〔2015〕001）。

作者简介 杨永涛（1992—），男，湖北广水人，硕士研究生，研究方向：植物资源综合利用。*通讯作者，教授，硕士，硕士生导师，从事植物资源综合利用研究。

收稿日期 2017-08-09

羅布麻为夹竹桃科白麻属大花罗布麻，维吾尔族语也称其为“野务其干”“陶格其干”等[1-2]。在我国新疆、青海和甘肃等省区广泛分布，新疆有丰富的野生罗布麻资源，主要分布在罗布泊、塔里木河及阿克苏地区[3]，可以防止土地沙漠化，全株可入药，被誉为“沙漠瑰宝”[4]。

罗布麻在烟草工业[5]、纺织[6]、成分鉴定[7-9] 、药理[10]等方面均有研究。研究者对罗布麻叶中总黄酮的含量测定、提取工艺进行了大量的探索，陈彦云等[11]采用超声波辅助的方法提取罗布麻中总黄酮；阿依古丽·塔什波拉提等[12]采用近红外光谱法快速测定罗布麻叶中总黄酮含量。工艺条件的探索中，溶剂、料液比、提取温度常被作为总黄酮提取效率的主要因素[11-13]，而对样品目数这一因素考虑研究较少。目前，罗布麻叶大多制成茶叶或者药材，而茎被大量遗弃[14]。通过对罗布麻茎的研究，可为罗布麻茎的深度开发利用提供理论指导，以期达到废弃资源的综合利用。该研究采用乙醇浸提法提取罗布麻茎中总黄酮，在单因素试验基础上，应用正交试验设计对影响总黄酮提取工艺较大的5个因素 （乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间及样品目数）进行优化，拟获得科学可行的工艺条件，以期为罗布麻的开发利用奠定基础，同时对其他天然产物的提取具有一定的借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 试材

罗布麻茎（购自新疆国药集团）；芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司，HPLC≥98%）；无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 仪器 DR6000型紫外可见分光光度计，哈希（上海）仪器有限公司；TDL-80-2B低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；其他一些常规的试验设备。

1.3 试验方法

1.3.1 罗布麻茎中总黄酮的提取。取少量罗布麻茎，室内晾干，粉碎、过40目筛。采用乙醇浸提法对罗布麻茎中总黄酮进行提取。

1.3.2 单因素试验。

采用 “1.3.1” 方法提取罗布麻茎中总黄酮。采用单因素试验，固定其他提取条件，分别考察乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间及样品目数对罗布麻茎中总黄酮提取率的影响。

1.3.3 正交试验设计。在单因素试验的基础上，以总黄酮的提取率为考察指标。通过L16（45）正交试验确定溶剂浓度、料液比、提取温度、提取时间及样品目数等因素的最佳组合，从而优化罗布麻茎中总黄酮的提取工艺。

1.3.4 罗布麻茎中总黄酮的测定。

1.3.4.1 标样溶液配制。

称取在 110 ℃真空干燥至恒重的芦丁标准品 20 mg 于 100 mL 容量瓶中，加 60%的乙醇溶解。定容至刻度，即为0.2 mg/mL 的芦丁对照品溶液，摇匀，冷藏备用。

量取 25 mL 上述0.2 mg/mL芦丁对照品溶液于 50 mL 容量瓶中，60%乙醇稀释至刻度，即可得到 0.1 mg/mL 的芦丁对照品溶液。

1.3.4.2 标准曲线的绘制[15]。

量取芦丁对照品溶液（0.1 mg/mL） 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于 10 mL 容量管中，加入 5% NaNO3溶液 0.3 mL，摇匀，静置 4 min； 再加 10% Al（NO3）3溶液 0.3 mL，摇匀，静置4 min；移液枪移取4% NaOH溶液 4 mL，超纯水稀释至 10 mL，摇匀，静置 15 min。

编号为0、1、2、3、4、5，以0號样品溶液为空白对照。在510 nm 波长处测定吸光度[16]，以芦丁对照品溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线方程。

1.3.4.3 总黄酮的测定。

将提取液离心、过滤，移取一定量澄清液。精确量取 1.00 mL，移至 10 mL容量管中。按照 “1.3.4.2” 中方法测定提取液吸光度。

总黄酮提取率Y=[（C×V2）/（V1×m×1 000）]×100%

式中，C为由标准曲线计算得到的提取液总黄酮质量浓度（mg/mL），V1为测定用提取液体积（mL），V2为样品提取液总体积（mL），m为样品绝干重量（g）。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准品的标准曲线

由图1可知，芦丁标准曲线回归方程为y=13.034x-0.007 5（R2=0.999 3），经检验P<0.01。因此，该回归方程可用于定量测定。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对罗布麻茎中总黄酮提取率的影响。

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，罗布麻茎中总黄酮的提取率也随之提高。当浓度高于60%，总黄酮的提取率呈现下降趋势，反而不利于总黄酮的提取。考虑到乙醇浓度过大会浪费原料，将浓度控制在50%～70%较为合适。

2.2.2 料液比对罗布麻茎中总黄酮提取率的影响。

由图3可知，总黄酮提取率随料液比的改变呈现先增大后降低的趋势，料液比在1 ∶40 （g ∶mL）时，提取率达到最大值，之后随料液比增大而平缓下降。增加浸提液体积，传质速率增大，更多的黄酮溶出，提取率增大。提取剂过多时，多余的提取剂稀释了提取液，传质速率减小，提取率减小。故将料液比控制在1 ∶20～1 ∶40较为合适。

2.2.3 提取温度对罗布麻茎中总黄酮提取率的影响。

由图4可知，温度较低时，总黄酮的提取率随温度升高而升高；温度高于60 ℃时，提取率增加缓慢并趋于平缓。可能温度过高会破坏黄酮类化合物的结构，导致部分黄酮类物质分解，故将温度控制为50～70 ℃较为适宜。

2.2.4 提取时间对罗布麻茎中总黄酮提取率的影响。

由图5可知，0～2 h时，总黄酮提取率随时间增加而显著提高；在2 h时，提取率达到最大值。2 h后，提取率出现缓慢下降，可能是一些黄酮类物质因受热时间较长而分解破坏。浸提时间过长杂质溶出增加，因此将提取时间控制为 1.5～2.0 h较为合适。

2.2.5 样品目数对罗布麻茎中总黄酮提取率的影响。

由图6可知，总黄酮提取率随样品目数的增大而呈现先增加后趋于平缓的趋势。样品目数越大，罗布麻茎粉末与浸提液的接触面积越大，接触愈加充分。当样品目数小于80时，提取率明显增加；当样品目数大于80目时，提取率基本保持平稳，可能是总黄酮的提取率已达到最大值；继续增大样品目数，反而会增加样品处理的难度。故将样品目数控制在80～100目较为合适。

2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，每个因素选取4个对总黄酮提取率影响较大的水平，建立五因素四水平的正交試验因素和水平表（表1）。

用 L16 （45）正交试验设计对罗布麻茎中总黄酮的提取工艺进行优化，结果表明（表2），各因素对提取率的影响程度从大到小依次为D、A、B、E、C，即料液比为主要影响因素，其次为乙醇浓度，提取温度、样品目数和提取时间对提取率影响较小。

对 L16（45）正交设计试验结果进行方差分析，结果发现，料液比对总黄酮提取率的影响显著，而乙醇浓度、提取温度、样品目数、提取时间对总黄酮提取率的影响不显著。

2.4 验证试验

为了验证正交试验结果，按照正交试验所得到的最佳工艺条件，即乙醇浓度50%、提取温度50 ℃、提取时间1.5 h、料液比为1 ∶40、样品目数100，重复试验6次。结果表明，罗布麻茎中总黄酮的平均提取率为2.036%，相对标准偏差 RSD为 0.321%，表明该工艺具有可重复性。

3 结论

单因素试验得到各个因素的适宜范围，但是单因素验未考虑到各因素之间的相互作用，需要正交试验进一步优化工艺条件。

采用正交试验设计对影响总黄酮提取率的乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比、样品目数进行研究，结果表明，各因素对提取率的影响从大到小依次为料液比、乙醇浓度、提取温度、样品目数、提取时间，即料液比对提取率影响最大，样品目数对提取率影响最小。

正交试验优化得出罗布麻茎中总黄酮的提取工艺为：乙醇浓度50%，提取温度50 ℃，提取时间1.5 h，料液比为1 ∶40，样品目数为100目，提取率达到2.033%。经验证，在该工艺条件下重复6次试验，罗布麻茎总黄酮的平均提取率为2.036%，相对标准偏差 RSD为 0.321%，表明该工艺条件重复性良好。

参考文献

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中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1977：157-158.

[2] 张卫明，肖正春，顾龚平，等.罗布麻资源利用与罗布麻植物分类问题[J].中国野生植物资源，2006，25（2）：15-19.

[3] 陈敏，赵学勇，左小安，等.荒漠生境罗布麻（Apocynum venetum）传粉生物学比较[J].中国沙漠，2016，36（1）：124-130.

[4] 刘斌，陈孝娟，于萍.新疆栽培种和野生种罗布麻叶中总黄酮含量分析[J].海峡药学，2017，29（2）：41-43.

[5] 赵翠.罗布麻全秆纤维烟草薄片纸基应用研究[D].广州：华南理工大学，2016.

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