无硫复合护色剂处理的干制苹果片中差异蛋白表达的分析

李新明 郭志利 李群

摘要 [目的]分析经无硫复合护色剂处理的苹果片在干制后差异蛋白的表达情况。[方法]采用无标记（Label-free）定量蛋白质组学技术对复合护色剂处理的干制苹果片进行蛋白质组学研究，探讨蛋白质组表达水平的差异。所提取的蛋白质样品经酶解、色谱质谱检测分析，用Label-free定性定量软件maxquant（1.5.0.12）结合搜库定性软件Andromeda，对每个样本进行定性定量，通过蛋白质相对定量的比较寻找差异表达蛋白。[结果]与非处理苹果片相比，差异蛋白总数为909个，上调差异蛋白质319个，下调差异蛋白质590个；生物学过程主要集中在代谢过程、细胞过程。分子功能主要在绑定、催化活性、能量代谢等部分。细胞组件主要集中在细胞膜相关的部件。[结论]该研究可为解析复合护色剂处理后干制苹果片中次生代谢物差异的成因及其抑制褐变的蛋白质机制提供参考。

关键词 干制苹果片；Label-free；褐变；护色；差异蛋白

中图分类号 TS255.42 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0071-03

Abstract [Objective] To analyze the expression of differentially expressed proteins in dried apple slices treated with sulfur free composite color protection agent.[Method] Proteomic analysis of dry apple slices treated with composite color protection agents was carried out using unlabeled （Labelfree） quantitative proteomic techniques to investigate the differences in protein expression levels.The analysis of the extracted protein samples by enzymolysis and GCMS detection，using Labelfree quantitative software maxquant （1.5.0.12） combined with qualitative database search software Andromeda，the qualitative and quantitative of each sample，the protein relative quantitative comparison for different expression of protein.[Result] Compared with untreated apple slices，the total number of differentially expressed proteins was 909，up to 319 differentially expressed proteins and 590 down regulated proteins.The biological process mainly focused on the metabolic process and the cellular process.The molecular functions were mainly binding，catalytic activity，energy metabolism and so on.Cell components were mainly concentrated in cell membrane related components.[Conclusion] This study can provide a reference for the analysis of the causes of the secondary metabolite differences in the dried apple slices and the mechanism of protein inhibition of browning.

Key words Dried apple slices；Labelfree；Browning；Color protection；Differential proteins

蛋白質組学分析方法已经在许多领域得到广泛应用，如生命科学领域（细胞生物学、神经生物学等），涉及的生物种类范围很多，如原核生物、真核生物、植物和动物等。在医学领域，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一[1]。蛋白质组学分析研究中需要使用多种方法，鉴定蛋白质需要应用质谱方法，标记或染色等可以通过定量分析等方法来完成。如今，不使用其他方法，同时实现蛋白质的定性和定量仅靠质谱就可完成，这就是无标记（Label-free）定量蛋白质组学研究方法，也是现在定量蛋白质组学研究的有效新方法，它直接利用蛋白质质谱鉴定中产生的肽段数据（重复肽段数和强度）进行蛋白相对定量[2-4]。

去皮后苹果的果肉褐变主要为酶促褐变，导致褐变的酶有很多种，其中多酚氧化酶是最主要的，酶促反应的进行需要4个因素，即氧、多酚氧化酶、底物、铜离子[5]。抑制这种反应可以通过除去氧，降低活性铜离子和底物浓度或直接钝化酶来实现[6]。还有一种褐变为非酶褐变。在苹果干制过程中，温度会引起果肉中各种蛋白的表达变化，通过检测这些功能蛋白的差异表达，可以从分子水平为褐变抑制提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料 供试苹果为太谷产的红富士苹果。

1.2 方法

1.2.1 样品处理。洗净苹果，将苹果切成 1 mm的薄片，均等分成2份；其中一份放置于空气中 4 h，同时另一份置于复合护色液中浸泡 4 h；将2份苹果放置于 45 ℃烘箱中烘至恒重。

1.2.2 蛋白质提取。

取样品 100 mg 于 5 mL 管中，加入 5 颗钢珠，液氮冻存 5 min，放入高通量组织研磨仪中，70 Hz 1 min；加入 1 mL Lysis buffer，漩涡振荡 30 s，冰上静置10 min；加入 100 mg 玻璃珠，漩涡振荡 30 s 后立即放入冰上冷却，重复 6 次；15 000 r/min 4 ℃离心 30 min，收集上清液；加入终浓度 25%的 TCA于-20 ℃ 2 h 沉淀蛋白，15 000 r/min 4 ℃离心10 min，去上清，蛋白沉淀用 80%丙酮洗涤3 次，小心去掉上清液，晾干 2～3 min；用 300 μL 8 mol/L urea（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0）复溶蛋白沉淀，BCA 蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，样品浓度最好≥2 mg/mL；样品置于-80 ℃内，待酶解。

1.2.3 蛋白质的酶解。先将蛋白用 10 mmol/L DTT 在 37 ℃ 下进行变性处理，随后加入 20 mmol/L IAA（iodoacetamide）室温反应 45 min 进行还原烷基化处理，蛋白样品用 100 mmol/L TEAB 稀释至尿素终浓度为 1 mol/L，首先加入 trypsin （1∶50） 过夜进行第1次酶解，第2次用 1∶100 trypsin 进行酶解 4 h。大概每个样本有 100 μg 的蛋白用 trypsin 进行了酶解。

在用 trypsin 进行酶解后，肽段混合物用 5%甲酸进行酸化处理后，通过 C18 Spin Columns 进行除盐处理；除盐洗脱产物用 Pierce TM Quantitative Colorimetric Peptide Assay 试剂盒进行定量，冻干，最后用一定量的流动相（0.1%甲酸水溶液）复溶肽段。

1.2.4 色谱质谱检测流程。

检测用 LTQ orbitrap Velos液质联用仪配备戴安ultramate 3000 nano-UPLC 进行分析，上机量 10 μL，首先进入保护柱（C18 PepMap100，300 μm×1 mm，5 μm，100 ），随后进入分析柱（AcclaimPepMap C18，15 cm×75 μm，2 μm，100 ，Dionex）以流速 0.2 μL/min 進行分析，流动相梯度为 5%～55%流动相 B（流动相 B：乙腈，0.1%甲酸；流动相 A：超纯水，0.1%甲酸）以 180 min 进行检测。

质谱参数：阳离子模式，CID 碰撞模式，120 000 分辨率，质量范围 350～1800，NCE 为 35%，前15 离子强度用于 MS-MS 分析。

1.3 分析方案

Orbitrap原始数据定性定量方法：对获得的Label free蛋白质原始数据，用Label free定性定量软件maxquant（1.5.0.12）结合搜库定性软件Andromeda，对每个样本进行定性定量，参考蛋白质数据库为uniprot（收录了共34 361条记录）。定性和检索方法：对每个样本进行“运行间匹配”，匹配时间窗口为0.5 min，对齐时间窗口为20 min。酶切类型为胰蛋白酶全酶切，母离子质量误差为±10×10-6，固定修饰为半胱氨酸，可变修饰为天冬酰胺、赖氨酸（肽段N端）和蛋氨酸（氧化），肽段和蛋白FDR<0.01，最少匹配unique peptide数目为1，同时采用LFQ和iBAQ两参数进行蛋白定量，对获得的蛋白结果过滤掉污染序列、反向序列等获得最后的结果用于后续分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白鉴定统计分析

经过定性定量分析，一共有15 180个潜在多肽的MS-MS数据，最终经过maxquant搜库以后共有7 988个多肽的MS-MS数据可以归属到已知蛋白，最终样本可以识别到1 797个蛋白（unique peptide≥1）。

2.2 功能注释

2.2.1 总体蛋白GO分析。

蛋白参与的生物过程（BP）、所处的细胞位置（CC）、发挥的分子功能（MF）三方面功能信息是GO数据库的重要包含内容，可以把不同的功能概念组合为DAG（有向无环图）的结构。在蛋白表达谱分析中，GO常用于提供蛋白功能分类标签和蛋白功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与蛋白差异表达现象关联的单个特征蛋白功能类或多个特征功能类的组合。

图1为GO的第2级（level 2）注释信息所整理的GO分布图。可以发现生物学过程主要集中在代谢过程、细胞过程。分子功能主要集中在绑定、催化活性、能量代谢等部分。细胞组件主要集中在细胞膜相关的部件。

2.2.2 差异蛋白分析。

2.2.2.1 柱状图分析。对A-/A+各蛋白的比例进行柱状图分析，考察蛋白的比例分布，发现大多数蛋白的比例的对数位于0附近（图2）。

2.2.2.2 差异分析。最后筛选LFQ信号强度差异倍数的log2值的绝对值在log2（1.5）以上[|log2（Fold change）|≥log2（1.5）]为最终差异的蛋白，最终获得差异蛋白数。差异蛋白总数为909个，其中下调总数为590个，上调总数为319个。

ID：蛋白编号，log2（A-/A+）：组别间倍性变化值的log2值，uniprot列为经过蛋白搜库之后的匹配结果。

3 结论

经复合护色剂处理的苹果片，在干制后，果肉中的蛋白差异表达分析并与非处理对照比较表明，差异蛋白总数为909个，其中下调总数为590个，上调总数为319个。其中，生物学过程主要集中在代谢过程、细胞过程。分子功能主要在绑定、催化活性、能量代谢等部分。細胞组件主要集中在细胞膜相关的部件。

参考文献

[1]尹稳，伏旭，李平.蛋白质组学的应用研究进展[J].生物技术通报，2014（1）：32-38.

[2] 赵慧辉，杨帆，王伟，等.无标记定量法研究冠心病不稳定性心绞痛血瘀证的差异蛋白质组[J].高等学校化学学报，2010，31（2）：285-292.

[3] 郭春燕，詹克慧.蛋白质组学技术研究进展及应用[J].云南农业大学学报，2010，25（4）：583-591.

[4] 杨倩，王丹，常丽丽，等.生物质谱技术研究进展及其在蛋白质组学中的应用[J].中国农学通报，2015，31（1）：239-246.

[5] 姜爱丽，钟璐，胡文忠，等.3种褐变抑制剂对减轻鲜切苹果褐变效果的影响[J].食品与发酵工业，2010，36（7）：45-48.

[6] 魏敏，周会玲，陈小利，等.低温贮藏对鲜切富士苹果褐变的影响[J].西北林学院学报，2011，26（5）：131-134.