枯草芽孢杆菌发酵产N—乙酰神经氨酸的分离提纯

高兰兰 袁丽霞 吴金勇

摘要 [目的]对GRAS认证的枯草芽孢杆菌发酵所得N-乙酰神经氨酸进行分离纯化，获得安全性高的目的产物。[方法]通过沸水浴破壁、菌液分离、活性炭脱色、乙醇分步沉淀除杂、乙酸结晶以及重结晶等工艺对枯草芽孢杆菌基因工程菌株经培养所得的N-乙酰神经氨酸发酵液进行分离纯化。[结果]分离纯化后，N-乙酰神经氨酸纯度在96.0%以上。[结论]研究结果为N-乙酰神经氨酸应用于食品、保健品等领域提供了质量保障。

关键词 枯草芽孢杆菌；N-乙酰神经氨酸；纯化

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0001-02

Abstract [Objective] The aim was to separate and purify of Nacetylneuraminic acid from Bacillus subtilis which has a Generally Recognized as Safe （GRAS） status to get the safe and good production.[Method] After the fermentation of Bacillus subtilis in right medium，Nacetylneuraminic acid，was obtained by eradicating cell wall in boiling water，separating impurity，decolorization process，ethanol precipitation，acetic acid crystallization，recrystallization and other steps.[Result] Through the high performance liquid chromatography （HPLC） detection，the purity of Nacetylneuraminic acid reached above 96.0%.[Conclusion] The results provide reference for the application of Nacetylneuraminic acid in health products and other fields.

Key words Bacillus subtilis；Nacetylneuraminic acid；Purification

N-乙酰神經氨酸，又称唾液酸（简称SA），属于唾液酸家族中最主要的一员。唾液酸是20世纪50年代最早从颌下腺黏蛋白中分离纯化而命名的，带有极强的负电荷，是一类含有9个碳原子且具有吡喃糖结构的酸性氨基糖的总称[1-2]。唾液酸属于神经氨酸的衍生物，广泛分布在各生物组织内，是细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分[3]，在许多糖与蛋白相互作用的生理过程中发挥着重要作用。由于唾液酸中大多数是N-乙酰神经氨酸，仅有少部分是以N-羟乙酰基神经氨酸、去氨基神经氨酸等形式存在，所以通常所说的唾液酸主要是指N-乙酰神经氨酸[4]。N-乙酰神经氨酸与人类有着密切的联系，能够促进婴幼儿大脑发育，可被应用于治疗流感、风湿性关节炎等疾病，与瘤细胞的黏附和转移有關，赋予细胞抗识别等众多生理功能与用途[5-8]，所以被广泛应用到食品、医药品、疾病诊断等领域，如添加到婴幼儿奶粉中，用于抗流感病毒扎那米韦的研发。因此，N-乙酰神经氨酸具有很大的经济价值与应用前景。

N-乙酰神经氨酸的生产方法有很多，如天然原料提取法、固定化酶法、全细胞生物催化法等[9-10]，而微生物发酵法由于生产成本低，纯化工艺相对简单，克服了其他方法中存在的纯化复杂、反应苛刻、成本高等缺点，成为了近几年的研究热点。目前，国内外主要是基于大肠杆菌基因工程菌发酵生产的研究，而关于枯草芽孢杆菌发酵产N-乙酰神经氨酸的报道相对较少。枯草芽孢杆菌是GRAS认证的安全菌株，遗传背景清晰、生长速率快、不具有致病性、发酵及基因操作技术成熟，并且不易受噬菌体污染[11-12]，是一种重要的工业生产菌株。笔者研究了从枯草芽孢杆菌发酵液中提取N-乙酰神经氨酸的方法，以期获得安全性高的目的产物，为其应用于食品、保健品等领域提供质量保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。枯草芽孢杆菌1505-SA-BS-G2-除芽孢由中国科学院合肥物质科学研究院等离子体物理研究所构建。

1.1.2 试剂与仪器。N-乙酰神经氨酸标准品：Sigma Aldrich公司；乙醇：国药分析纯；乙酸：国药分析纯；0.22 μm微孔滤膜：上海半岛实业有限公司；台式离心机：Allegra X-30R，Beckman公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；正（负）压过滤器：海宁市亚泰制药机械有限公司。

1.1.3 培养基。

种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L。发酵培养基：甘油 20 g/L，酵母粉16 g/L，磷酸二氢钾 5 g/L，硫酸铵 4 g/L，柠檬酸钠 2 g/L，七水硫酸镁 1 g/L，IPTG 2 mmol/L，VB1 0.004 9 g/L，微量元素 1 mL/L（微量元素母液：FeSO4·7H2O 3.500 g/L，MnCl2·4H2O 0.600 g/L，CoCl2·6H2O 0.100 g/L，CuCl2·2H2O 0.065 g/L，H3BO3 0.370 g/L，ZnSO4·7H2O 1.200 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.160 g/L）。

1.2 方法

1.2.1 发酵培养。

用接种环蘸取少量甘油管菌液，接种至10 mL液体LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养5 h，得到一级种子液；将一级种子液1%接种量转接至80 mL 液体LB培养基，同上培养；将微量元素和硫酸镁的混合液，以及培养5 h的二级种子液，依次加入到各参数已稳定的5 L发酵罐中开始培养[pH设为6.80，通过25%（m/V）的氨水来维持调节pH。温度设为37 ℃，溶氧保持在30%以上，开始发酵培养]。

该发酵采用补料分批发酵的方法，以甘油为主要碳源，发酵约4 h后甘油耗完，开始补加碳源，发酵约108 h，最终N-乙酰神经氨酸产量为8.6 g/L。

1.2.2 N-乙酰神经氨酸的分离提纯。

1.2.2.1 破壁处理。将培养后的发酵液盛在敞口的玻璃器皿里，置于恒温水浴锅中，沸水浴加热5 min（加热过程中要确保搅拌均匀），使菌体细胞壁充分破坏，胞内产物释放到液体中。

1.2.2.2 菌液分离。将破壁后的发酵液8 000 r/min离心5 min，收集上清液。

1.2.2.3 活性炭脱色。向上述上清液加入1%活性炭，室温下搅拌10 min，用0.22 μm膜抽真空过滤，脱掉色素等部分杂质。

1.2.2.4 浓缩。将脱色后发酵液置于旋转蒸发仪中，50 ℃下进行减压蒸发浓缩，浓缩至80 g/L左右。

1.2.2.5 除蛋白。向上述浓缩液加入盐酸，调节其pH为3.5，加入1倍体积乙醇溶液，搅拌均匀，静置后出现白色絮凝状沉淀（其成分主要为杂蛋白），用微滤膜抽真空過滤，收集上清液。

1.2.2.6 乙醇分步沉淀除杂。继续浓缩上述上清液，同时回收乙醇，将其浓缩至80 g/L左右。重复上述步骤，调节pH后，加入乙醇再次沉淀除杂。

1.2.2.7 乙酸初结晶。继续浓缩分步除杂后的上清液至200 g/L，加入4倍体积乙酸， 4 ℃结晶24 h。

1.2.2.8 洗涤干燥。用无水乙醇洗涤结晶后所得的晶体3次，60 ℃烘干至恒重，检测N-乙酰神经氨酸含量。

1.2.2.9 重结晶。

用4倍体积乙酸对一次结晶后的样品重结晶，无水乙醇洗涤并烘干，得重结晶样品。

1.2.3 N-乙酰神经氨酸的检测。

利用HPLC进行检测样品中N-乙酰神经氨酸的含量。高效液相色谱型号：岛津Lc-15c。

检测条件：检测柱 Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic Analysis Column （300.0 mm×7.8 mm） ；柱温 60 ℃；流动相是 6 mmol硫酸，流速0.6 mL/min；检测波长 210 nm。

2 结果与分析

2.1 乙醇分步沉淀法的选择

枯草芽孢杆菌培养后的发酵液比较黏稠，杂质较多，浓缩后的发酵液愈发黏稠，直接加乙酸结晶不能达到纯化的目标。经过试验，发现乙醇可除去部分蛋白和杂质，但因枯草芽孢杆菌发酵液中N-乙酰神经氨酸浓度不高，在8～10 g/L，发酵液大部分是杂质，高浓度浓缩后混合液变性成黏性的凝胶状物质，再用乙醇处理很难除去杂质。经过多次研究发现，乙醇分步沉淀是一种有效去除蛋白质和杂质的方法。首先浓缩液浓缩到80 g/L左右，然后调pH至3.5，再加入1倍体积乙醇，然后采用微滤膜进行过滤。收集滤液，滤液再次蒸发浓缩，重复上述步骤，2次沉淀除杂后，即可除去大部分蛋白质和杂质。一次乙醇处理后有较多的杂质析出，且第2次1倍乙醇处理后仍可观察到有杂质，说明1倍乙醇2次处理的必要性。因此，选用2步1倍乙醇沉淀法进行除杂。

2.2 结晶溶剂及结晶条件的确定

溶剂结晶法是生化分离过程中常用的提纯方法，微生物发酵液中，一般含有大量的菌体、蛋白质、色素、无机盐等杂质，这就需要通过各种理化方法对目标产物进行提纯。利用溶剂结晶法，可以使杂质（结晶母液中）与产品（固体）分离开来，达到提纯的目的。对于结晶溶剂的选择，理论上应根据提纯产物在溶剂中的溶解度、溶剂的介电常数和溶剂的理化性质等来考虑，一般选择介电常数小、与水互溶性好的有机溶剂。通过对多种溶剂研究对比发现，虽然乙酸沸点（117.9 ℃）相对较高，但乙酸介电常数较小，在20 ℃时只有6.2，2 ℃时只有4.1，较小的介电常数使溶质在其中较难解离；同时乙酸与N-乙酰神经氨酸在溶液中带有相同的电荷，带有相同电荷的离子在溶液中不可能聚集，只有相互排斥。另外乙酸能够与水以任意比互溶，且N-乙酰神经氨酸也是一種水溶性溶剂，在水中溶解度较大，而N-乙酰神经氨酸在乙酸中溶解度却较小。以上性质显示，且试验结果也证实，乙酸是一种优良的结晶提纯N-乙酰神经氨酸的溶剂。

确定了结晶溶剂，进一步对乙酸结晶提纯的条件进行了研究，首先对浓缩液进行浓缩，浓缩后加入不同体积的乙酸进行结晶。结果表明，当加入1～3倍体积的乙酸时，均未出现结晶；而加入4～7倍体积的乙酸时，均出现了结晶。在4倍体积乙酸条件下，结晶后N-乙酰神经氨酸纯度达68.9%，然而N-乙酰神经氨酸的纯度并不随乙酸体积的增加而明显变化。因此，选择4倍体积乙酸来进行结晶。

2.3 重结晶

把纯度60.0%～70.0%的晶体进行重结晶。首先把晶体溶于水中，配成浓度200 g/L的水溶液，然后加入4倍体积的乙酸，低温结晶。晶体用无水乙醇洗涤，然后烘干检测。结果显示，重结晶后N-乙酰神经氨酸纯度均提高到96.0%以上（表1）。

2.4 N-乙酰神经氨酸的分离提纯工艺流程

对枯草芽孢杆菌5 L罐发酵108 h，发酵液中N-乙酰神经氨酸含量为8.6 g/L左右，根据试验结果设计了N-乙酰神经氨酸的提取工艺流程（图1）。

对发酵液经该工艺流程处理，最后所得N-乙酰神经氨酸成品，经测定纯度均在96.0%以上。

3 结论

由该研究构建的整合性枯草芽孢杆菌经发酵培养得到的N-乙酰神经氨酸发酵液含N-乙酰神经氨酸8～10 g/L，对该发酵液进行菌液分离、脱色、除杂除蛋白、浓缩、结晶、重结晶等分离提纯后，可得到纯度96.0%以上的N-乙酰神经氨酸结晶样品，为大规模发酵产N-乙酰神经氨酸的分离提纯提供技术方法，为枯草芽孢杆菌生产的N-乙酰神经氨酸的应用奠定基础。

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