多菌灵杀菌剂对青海弧菌和斑马鱼的急性毒性研究

熊昭娣　周梦颖　高翔　郭印　谢剑

摘要[目的]研究农药对农田环境及非靶标有益生物的影响。[方法]选取青海弧菌Q67和斑马鱼作为受试生物，研究多菌灵杀菌剂对其的急性毒性，从而初步评价该杀菌剂农业生产应用中对水生生物的潜在风险。[结果]22%多菌灵杀菌剂对青海弧菌Q67的EC50为7.70 mg/L，pEC50为2.11；22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的24、48、72、96 h LC50分别为8.53、8.39、8.07和7.64 mg/L；斑马鱼的安全浓度为0.76 mg/L。[结论]根据《化学农药环境安全评价试验准则》“鱼类急性毒性试验”对鱼类毒性评价标准，判断22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的毒性属中毒。

关键词多菌灵；青海弧菌Q67；斑马鱼；急性毒性

中图分类号S948文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0103-03

Acute Toxicity of Carbendazim to Q67 （Vibrio-qinghaiensis sp） and Zebra Fish （Brachydanio rerio）

XIONG Zhaodi1， ZHOU Mengying2， GAO Xiang1， XIE Jian3* et al

（1. Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry， Shanghai 201699；2. Jinshan District Agricultural Technical Extension Station， Shanghai 201507；3. Animal Husbandry and Fishery Bureau of Louxing District， Loudi，Hunan 417000）

Abstract[Objective]Effects of carbendazim on agriculture environment and nontarget beneficial organisms were studied. [Method]Q67 and zebra fish were selected as a test organism to study the acute toxicity of carbendazim ， thus the potential ecological risks of carbendazim to aquatic organisms was preliminarily evaluated . [Result] EC50 to Q67 of 22% carbendazim was 7.70mg/L， pEC50 was 2.11；the 24 h，48 h，72 h and 96 h LC50 of 22% carbendazim to the testing fish were 8.53，8.39，8.07 and 7.64 mg/L， respectively. The safe concentration of carbenzim to zebra fish was 0.76 mg/L. [Conclusion]Acute toxicity of 22% carbendazim to fish is medium according to the “Fish Acute Toxicity Test” of the Chemical Pesticide Environmental Safety Evaluation Test Guidelines.

Key wordsCarbendazim；Q67；Zebra fish；Acute toxicity

我國是农业大国，也是生产和消费农药的大国，农药在防治农作物病虫草害方面发挥着重用作用，但在使用过程中70%～80%的农药未达到防治靶标的作用，而是直接分散到环境中，这其中又有部分随地表径流进入水环境，一旦农药进入水环境中，就会单独或与其他污染物混合共同对水体中动植物产生影响，并可能发生迁移转化进入土壤和农作物，在食物链的循环中进入人体，影响生态系统和人类健康[1]。

多菌灵属于苯并咪唑类农药杀菌剂，是1967年由美国杜邦公司开发的杀菌剂苯菌灵的中间产物，主要用于防治水稻、蔬菜类的病害，化学性质稳定，具有高效低毒等特点[2]。美国和欧盟国家已将多菌灵列为禁用农药，我国《食品中农药最大残留限量》（GB2763—2005）国家标准规定多菌灵在柑橘、香蕉和芒果中残留最大限量为0.15 mg/kg，欧盟对柑橘和香蕉的规定分别为5.00和1.00 mg/kg[3]。近年来，对多菌灵的研究较多，如高浓度多菌灵对植物体内的多种酶存在影响[4]，广西和福建荔枝园土壤样本中，多菌灵残留的检出率分别为48.1%和84.0%[4]；田间试验中在收获的水稻稻秆和谷壳中发现残存的多菌灵，以此作为饲料有一定的风险[5]；芝麻[6]、食用菌[7]、苹果[8]等种植过程中使用多菌灵后会有少量残留。可以看出，目前关于多菌灵的研究主要集中在对农产品残留限量上，而多菌灵对水生生物的毒性研究较少，虽然在Satapornvanit K等[3]的研究中涉及到多菌灵在水产养殖上的应用，但未能对其毒性进行量化。笔者选取青海弧菌Q67和斑马鱼作为受试生物，通过微板毒性分析法和急性毒性试验，初步评定22%多菌灵杀菌剂对水生生物的潜在风险，旨在为多菌灵的安全使用提供借鉴。

1材料与方法

1.1试验材料

试验菌种为青海弧菌Q67，菌种的培养与保存参照文献[9-10]；急性毒性试验对象为0～1龄斑马鱼；试验用水位经过充分曝气且经过检测为无氯的自来水，试验容器为47 cm×58 cm×77 cm的蓝色塑料箱。

试验所用农药为含22%多菌灵、8%戊唑醇的混合悬浮杀菌剂（江苏龙灯化学有限公司）。化学分子式：C9H9N3O2，相对分子质量：191.19，其结构式如下[1]：

图1多菌灵的结构式

Fig.1Chemical structures of carbendazim

试验仪器为Infinite M200酶标仪（瑞士TECAN公司）、DL-CJ-IF超净工作台（哈东联）、150C型恒温振荡培养箱（金坛市亿通电子有限公司）、高压灭菌锅（Sanyo公司）、BT25S型电子天平（赛多利斯公司）。

1.2发光细菌毒性测试方法

多菌灵悬浮杀菌剂的毒性测定采用微板毒性分析法（MTA）[11]。在96孔微板第1横排的12个孔中均加入100 μL milli-Q 水作为空白对照，在第2横排的12个孔中分别加入依据在预毒性试验中所得稀释因子稀释的12个浓度，浓度从大到小呈几何级数递减，尽可能地使各浓度产生的发光抑制率（E）比较均匀地分布在最高效应与最低效应之间，第3、4横排中13孔设为第2横排相应各孔样品的平行试验，每一个孔都用milli-Q水补足至100 μL，再用12道移液器依次从微板第1～4排各孔中加入100 μL培养好的菌液，使每孔内溶液总体积均为200 μL。15 min后，在酶标仪上测定各孔相对发光度（I）。以空白对照组的发光强度（I1）与各浓度梯度组的发光强度计算各浓度对青海弧菌Q67的发光抑制率（E）。为获得高精度毒性数据，重复3板。

1.3急性毒性試验

据预备试验结果，按等对数间距设立7个浓度组，重复数4次。每个试验容器分别放入15尾受试斑马鱼，按设定浓度添加试验药物。试验期间，室内自然光照，连续微波充气，水温控制在（30±1）℃，毒性试验时间分别为96 h。

受试前1 d开始停食。试验过程中不投饵，不换水。定时观察斑马鱼的活动情况。沉底后鳃盖微张被视为昏迷，而经解剖针轻触后无明显反应的个体则被视为死亡，准确记录24、48、72、96 h的个体死亡数。

1.4数据处理

青海弧菌Q67百分比发光抑制率的计算公式：

E（%）=（1-I2/I1）×100%（1）

式（1）中，E为发光抑制率；I1为空白组的发光强度；I2为与毒物作用后的发光强度。

斑马鱼校正死亡率的计算公式：

w（%）=（q0-c）/（1-c）×100（2）

式（2）中，q0为未校正死亡率，c为对照组死亡率。

仔虾的安全浓度计算公式[12]：

SC=0.1×96 h LC50（3）

将校准死亡率换算成概率单位后与相应浓度的对数求

回归方程，根据回归方程计算斑马鱼的半致死浓度LC50。

利用Excel和Origin75统计软件进行数据处理和统计，拟合剂量-效应曲线，根据拟合模型计算农药样品与青海弧菌Q67作用15 min的半效应浓度（EC50），并以此判断农药样品对青海弧菌Q67毒性的大小。

2结果与分析

2.12种多菌灵杀菌剂对青海弧菌Q67的毒性

作用时间15 min时，22%多菌灵杀菌剂对Q67的剂量-效应拟合曲线见图2。由图2可知，随着杀菌剂浓度质量分数的升高，青海弧菌Q67的发光抑制率逐步升高，两者呈正相关；22%多菌灵杀菌剂对青海弧菌Q67的EC50为7.70 mg /L，pEC50为2.11。

2.222%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的急性毒性作用

22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的急性毒性试验结果见表2。22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼LC50值随时间延长而变小，毒性增加，其24、48、72、96 h LC50分别为：8.53、8.39、8.07和7.64 mg/L；斑马鱼的安全浓度为0.764 mg/L。

试验观察发现，低质量浓度组的斑马鱼中毒症状不明显；高质量浓度组的斑马鱼鱼鳃充血，兴奋异常，尤其是高浓度处理，随着试验时间的增加，试验对象开始失衡，鱼体侧翻，身体扭曲变形，尾部痉挛，在水中上下翻滚，腹部朝上，鱼体发白，逐步出现死亡。

3结论与讨论

目前，将发光细菌应用于污染物毒性测定是进行生物毒性检验的毒理学检测方法之一，发光菌主要有海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）和淡水青海弧菌Q67（Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67）。青海弧菌Q67是1985年我国学者分离出的一种新型淡水发光菌[13]，在朱文杰等[14]的共同努力下，建立了使用Q-67为菌种，以Veritas TM 微孔板光度计为发光强度测试设备的淡水发光菌毒性测试方法（MTA法），在pH范围为65～11.0时均能生长良好，对毒物的反应敏感。该方法具有应用范围广、易于操作、相关性好、反应快速等特点[15]。国内研究学者利用青海弧菌Q67对取代酚类、重金属等环境污染物进行了急性毒性的研究，已取得较好地效果[9]。通常认为发光细菌的光反应是在荧光素酶的催化作用下进行的，其还原形式（FMNH2）结合分子中的NO2、-OH和-NH2等氢键结合，发生氧化还原反应，生成黄素单核苷酸、核酸和水，并伴随着光的释放过程[10]。当青海弧菌Q67接触到农药时，其正常的新陈代谢会受影响，其表现为发光强度受到抑制，从而反应农药的毒性效应[11]。

根据试验，获得22%多菌灵杀菌剂对青海弧菌Q67的EC50为7.70 mg /L；若以EC50为毒性指标，22%多菌灵杀菌剂对青海弧菌Q67的毒性高于敌百虫（1.06×10-2 mol/L），但低于吡虫啉（2.64×10-4 mol/L）、抗蚜威（5.12×10-4 mol/L）[16]。姜丹等[17]报道磷酸三苯酯、亚磷酸二苄酯、眼磷酸二苯酯、亚磷酸三丁酯对青海弧菌Q67的EC50毒性为1.91×10-5～3.11×10-5 mol/L，其毒性均高于多菌灵，这些有机磷酸酯中含有芳香环数为2～3个，从多菌灵的化学结构可知，多菌灵含有1个苯香环结构，由此可以进一步证实，芳香环数越多，污染物对发光菌Q67的急性毒性越大。邹立等[18]和汝少国等[19]也认为含苯环结构越稳定，其取代基与苯环形成的离子域大π键越大，电子云密度越大，污染物毒性越强。

根据现行农药对鱼类毒性的分级标准（剧毒，LC50 0.1 mg/L；高毒0.1 LC50 1.0 mg/L；中毒，1.0 LC50 10.0 mg/L；低毒，LC50> 10.0 mg/L）[20]，而22%多菌灵杀菌剂96 h LC50为7.64 mg/L，对斑马鱼毒性中毒；研究发现，22%多菌灵杀菌剂对斑马鱼的毒性大于25%甲霜·霜霉威可湿性粉剂（96 h LC50为120.0 mg/L）[21]、300g/L 双酰草胺乳油（96 h LC50为31.19 mg/L[21]）和35%吡·异可湿性粉剂（96 h LC50为8905 mg/L）[21]，但小于25%氟虫腈悬浮剂（96 h LC50为0.60～0.81 mg/L）[20]和10%吡唑草胺乳油（96 h LC50为271 mg/L）[21]。研究发现，不同农药对斑马鱼的急性毒性没有规律可循，这可能与药剂的活性特点和加工剂型有关。丁悦等[22]研究发现50%多菌灵悬浮剂对斑马鱼毒性为低毒；刘彦良等[23]研究发现20%二甲戊灵微囊悬浮剂及20%二甲戊灵乳油对斑马鱼的96 h LC50分别为57.81和0.31mg/L，二者相差186倍。

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