紫苏梗酶解糖化条件优化

赵莉娟 胥江河 王星敏 邵承斌 曾雪

摘要：【目的】研究復合酶制剂催化水解紫苏梗的适宜条件，为紫苏梗生物质资源化利用提供技术支持。【方法】选用质量比4∶25∶12的纤维素酶、木聚糖酶和漆酶为复合酶制剂，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法，以还原糖含量（Y）为响应值，建立紫苏梗水解糖化的数学模型和优化其工艺参数，并探究复合酶制剂投加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）和pH（D）4个因素对复合酶制剂催化水解紫苏梗组织纤维的影响。【结果】建立的紫苏梗催化水解二次多项回归方程为Y=107.28+7.26A+6.88B+3.09C-1.68D-20.57A2-19.41B2-18.42C2-28.26D2-3.63AB-4.98AC-

2.93AD+1.93BC-1.20BD-1.33CD，其中复合酶制剂投加量对紫苏梗还原糖含量影响极显著（P<0.01），酶解时间影响显著（P<0.05）。复合酶制剂催化水解紫苏梗的最佳工艺条件为：在复合酶制剂投加量1.0 g、酶解温度45 ℃、pH 5的条件下酶解5.4 h，可水解产还原糖108.8 mg/g，与预测值相差0.1 mg/g。【结论】采用响应曲面法优化获得的复合酶制剂催化水解紫苏梗产糖工艺，具有试验周期短、耗能低等优点，建立的数学模型对优化工艺具有可行性，可用于实际预测。

关键词： 紫苏梗；酶解；还原糖；工艺优化

中图分类号： TK6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1054-08

Optimization of enzymatic saccharification for perilla stem

Abstract：【Objective】The appropriate conditions for compound enzyme preparation to catalyze hydrolysis of perilla stem were studied in order to improve the resource utilization of perilla stem. 【Method】Using compound enzyme with cellulase， xylanase and laccase（mass ratio 4∶25∶12）， on the basis of single factor experiment， response surface methodology was conducted. With reducing sugar content（Y） as response value， the mathematical model and optimization process parameters of hydrolysis and saccharification of perilla stem were established. And effects of compound enzyme dosage（A）， enzyme hydrolysis time（B）， enzymolysis temperature（C） and pH（D） on hydrolysis of perilla stem tissue fiber by compound enzyme preparation were investigated. 【Result】Two regression equations of catalytic hydrolysis of perilla stem were established： Y=107.28+7.26A+6.88B+3.09C-1.68D-20.57A2-19.41B2-18.42C2-28.26D2-3.63AB-4.98AC-2.93AD+1.93BC-

1.20BD-1.33CD. The dosage of compound enzyme had extremely significant influence on content of reducing sugar in perilla stem（P<0.01）， and enzymolysis time had significant influence on it（P<0.05）. When 1.0 g compound enzyme preparation were applied for saccharification of perilla stem， saccharification rate of 108.8 mg/g was obtained after 5.4 h hydrolysis at 45 ℃ and pH 5.Relative deviations was 0.1 mg/g compared to expected value. This was the optimum process for hydroly-

zing perilla stem by compound enzyme preparation. 【Conclusion】The optimization of enzyme catalyzed hydrolysis of perilla stem saccharification process obtained by response surface method has a short test period and low energy consumption. The mathematical model of the optimization process is feasible， and can be used in actual forecast.

Key words： perilla stem； enzymolysis； reducing sugar； process optimization

0 引言

【研究意义】以生物质为原料生产燃料乙醇是解决能源危机和环境问题、保持社会可持续发展的一条有效途径（金士威等，2006；张鸭关等，2016）。我国天然木质纤维素类生物质丰富，仅农作物秸秆和皮壳每年产生约7.0×108 t（张继泉等，2002）；废弃的生物质同样含有丰富的碳素，全部培耕还田如处理不当不仅引发农村面源污染，还会导致生物质资源浪费。紫苏系一年生草本植物，是国家卫生部首批颁布的药食同源植物之一（张志军，2011）。目前紫苏的利用主要集中在紫苏籽及紫苏叶上，紫苏梗除少量入药外，虽有资源化提取紫苏梗中黄酮类物质（李秀信等，2002）、挥发油（任淑清等，2008）、迷迭香酸（温献业等，2014）等报道，但大多被丢弃或焚烧，综合利用率极低。紫苏梗富含木质纤维素，其纤维素和半纤维素含量达62.7%（张志军，2011）。若将紫苏梗有效水解成葡萄糖，进一步开发成生物质燃料乙醇等，不仅有利于改善资源紧缺、环境恶化的现状，还对人类社会实现可持续发展具有重要的经济和社会意义。【前人研究进展】生物质水解糖化是生物质燃料乙醇生产过程中关键的一步（Turon et al.，2008）。目前，生物质水解方法主要有酸解法、超（亚）临界法、蒸汽爆破法、离子液体水解法和酶解法等。其中，酸解法需在高温、高压下进行，耗能高，副产物较多，且因酸对设备的腐蚀作用，故该法对设备的要求较高（Lin and Tanaka，2006）。超（亚）临界法和蒸汽爆破法虽能有效打破木质素的桎梏作用，但对试验条件要求较高，投资成本高，制约了生物质大规模生产（徐桂转和常春，2012）。酶解法具有产糖率高、副产物少、生产条件可控等优点（李梦雪等，2013；刘品华等，2016），在生物质水解产糖技术中运用广泛，如吕学斌等（2008）利用响应曲面法对玉米秸秆酶水解条件进行优化，结果表明，响应曲面所得最优条件较单因子试验中玉米秸秆酶水解产糖率高；任天宝等（2010）采用稀酸对稻草秸秆进行预处理后，可提高稻草秸秆酶解液的产糖率；张伟等（2015）探讨纤维素酶水解小麦秸秆产糖的最佳工艺条件，结果表明，在最优条件（底物质量分数8.0%、温度50 ℃、pH 5.4、酶投加量35 FPU/g）下水解96 h，还原糖产率为60.73%。【本研究切入点】植物组织中木质素致密结晶结构阻碍纤维素和半纤维素的水解转化，因此木质素去除效果直接影响生物质资源化利用。目前仅有李梦雪等（2013）利用纤维素酶催化水解紫苏梗产糖，但单一酶通常不能同时降解纤维素、半纤维素和木质素3种物质，至今尚未见复合酶催化水解紫苏梗产糖的研究报道。【拟解决的关键问题】采用单因素试验和响应曲面法，优化复合酶催化水解紫苏梗产糖的适宜工艺参数，并解析因素间的交互作用，为紫苏梗生物质资源化利用提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

紫苏梗采自重庆市南川区。纤维素酶（50000 U/g）购自和氏璧生物技术有限公司，木聚糖酶（50000 U/g）购自深圳市绿微康生物工程有限公司，漆酶（2000 U/g）购自苏柯汉（潍坊）生物工程有限公司；盐酸、氢氧化钠购自成都市科龙化工试剂厂。

主要儀器设备：KC-1000高速粉碎机（北京开创同和科技发展有限公司）；SHZ-D（III）循环式真空泵、SHA-C水浴振荡器（巩义市予华仪器责任有限公司）；EL104电子天平、Phs-3C酸度计（成都世纪方舟科技有限公司）；80-2型高速离心机（上海君竺仪器制造有限公司）；SAB-40C生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 复合酶制剂催化水解紫苏梗 根据紫苏梗植物组织成分，选取质量比4∶25∶12的纤维素酶、木聚糖酶、漆酶作为复合酶制剂。称取2.00 g过60目筛的紫苏梗置于100 mL锥形瓶中，加入0.6～1.4 g复合酶制剂和40 mL蒸馏水，调节pH 3～7，混匀后于35～55 ℃水浴摇床中酶解3.0～7.0 h；取出冷却至室温，过滤、离心后得澄清溶液，待测；固体渣集中收集，待进一步资源化利用。

1. 2. 2 紫苏梗还原糖含量测定 采用SAB-40C生物传感分析仪测定还原糖含量（YRS）。

YRS=CRS×V/m

式中，CRS为还原糖质量浓度（mg/L）；V为溶液总体积（L）；m为紫苏梗质量（g）。

1. 2. 3 单因素试验 考察复合酶制剂投加量（0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 g）、酶解时间（3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 h）、酶解温度（35、40、45、50和55 ℃）和pH（3、4、5、6和7）对还原糖含量的影响。

1. 2. 4 响应曲面优化紫苏梗产糖工艺 在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken原理，以复合酶制剂投加量、酶解时间、酶解温度和pH为自变量，以还原糖含量为响应值，利用Design-Expert v8.0设计4因素3水平的响应面分析试验，因素水平编码见表1。

1. 3 统计分析

采用Design-Expert v8.0对响应曲面试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 影响紫苏梗转化产糖的单因素分析结果

2. 1. 1 复合酶制剂投加量对紫苏梗还原糖含量的影响 生物质经酶催化水解产糖与酶制剂种类及其投加量有关。由图1可知，在固定酶解时间4.0 h、酶解温度45 ℃、溶液pH 5的条件下，当复合酶制剂投加量由0.6 g增至1.0 g时，紫苏梗水解产糖速度迅速增加，还原糖含量可达58.8 mg/g。这是因为增加酶制剂投加量，可适当增加酶与底物接触机会，增加接触位点，促使酶与底物接触位点接近饱和。当复合酶制剂投加量大于1.0 g时，还原糖含量明显降低，表明酶与底物的接触位点已达饱和，不会随复合酶制剂投加量的增加而增加；且随着复合酶制剂投加量的增加，反应体系中生成产物除还原糖外，戊糖等其他水解产物随之增加，其中戊糖会结合体系中的酸转化为糠醛（李颖畅等，2014），影响反应体系的酸碱性，进而影响酶活性，抑制植物组织的水解糖化。

2. 1. 2 酶解时间对紫苏梗还原糖含量的影响 由图2可知，在固定复合酶制剂投加量1.0 g、酶解温度45 ℃、溶液pH 5的条件下，紫苏梗催化水解在3.0～5.0 h范围内还原糖含量迅速增加，在5.0～6.0 h时趋于平缓，且在6.0 h时还原糖含量达最大值（51.2 mg/g）。分析其原因，在酶解反应初期，酶与底物充分接触，酶解速率较快，随着酶解时间的延长，根据稀释效应，反应液中的还原糖含量越来越高，会对酶解反应产生抑制作用（杨青丹和胡婷春，2010）；且酶解时间过长容易促使糠醛等发酵抑制物的产生，对后续发酵工艺产生不利影响（路鹏等，2006）。

2. 1. 3 酶解温度对紫苏梗还原糖含量的影响 酶具有最适温度，其催化作用受温度影响较明显。从图3可看出，在固定复合酶制剂投加量1.0 g、酶解时间6.0 h、溶液pH 5的条件下，隨着酶解温度的升高，还原糖含量逐渐增加，于50 ℃下达最大值（47.5 mg/g）；超过50 ℃后，还原糖含量快速下降。这是因为酶的适宜温度范围一般在45～65 ℃（杨青丹和胡婷春，2010；张霞等，2014）；在最适温度范围内，温度升高，活化分子数会相应增多，进而提高酶活性，促进酶解反应；但温度过高会使酶蛋白质结构变性而失活，导致还原糖转化降低。

2. 1. 4 pH对紫苏梗还原糖含量的影响 由图4可知，在固定复合酶制剂投加量1.0 g、酶解时间6.0 h、酶解温度50 ℃的条件下，紫苏梗还原糖含量随溶液pH的增大呈先增加后减少的变化趋势，当pH为4时，还原糖含量最高，略低于Insu等（2010）提出的酶最适pH范围4.5～5.5。其原因是溶液pH改变会破坏酶的空间结构，影响酶活性中心催化基团的功能，进而影响酶解反应的速率和酶解产率（刘娜等，2005；李梦雪等，2013）；pH过高或过低均会破坏酶的结构且失活，从而影响纤维素的降解作用，还原糖含量因此降低。

2. 2 紫苏梗催化水解产糖的响应曲面优化结果

2. 2. 1 Box-Behnken设计条件及结果 根据单因素试验确定的水平范围，利用Design-Expert v8.0设计的试验条件及试验结果见表2，所得复合酶制剂投加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）、pH（D）与还原糖含量（Y）之间的二次多项回归方程为：Y=107.28+7.26A+

6.88B+3.09C-1.68D-20.57A2-19.41B2-18.42C2-28.26D2-

3.63AB-4.98AC-2.93AD+1.93BC-1.20BD-1.33CD。

2. 2. 2 模型显著性检验结果 由表3的方差分析结果可知，模型P<0.01，表明该模型影响极显著，说明此模型拟合性好，可用该模型对紫苏梗的还原糖含量进行测定和分析。由F可知，影响紫苏梗还原糖含量的因素排序为：A>B>C>D，即复合酶制剂投加量>酶解时间>酶解温度>pH。结合表3中回归模型方差分析结果和二次多项回归方程，进一步分析4个因素不同项对还原糖含量的影响发现，一次项中，A影响极显著（P<0.01，下同），B影响显著（P<0.05），C和D影响均不显著（P>0.05，下同）；二次项中4个因素的影响均极显著，但交互项的影响均不显著。

2. 2. 3 响应曲面分析结果 由图5～图10可知，还原糖含量均呈先增加后减少的变化趋势，在中心点附近达响应值的最高点。由图5可知，随着复合酶制剂投加量的增加和酶解时间的延长，还原糖含量逐步提高，复合酶制剂投加量和酶解时间存在协同效应。在本研究水平范围内，复合酶制剂投加量和酶解时间分别在0.8～1.3 g和3.4～6.0 h范围内，还原糖含量可达最大值。沿着复合酶制剂投加量方向有较明显的变化趋势，说明复合酶制剂投加量对还原糖含量的影响较强。

同样的协同作用也表现在图6～图10。由图6和图7可知，复合酶制剂投加量与酶解温度及pH对还原糖含量的影响均呈抛物线型，随着酶解温度的升高、pH和复合酶制剂酶投加量的相应增大，还原糖含量呈先增加后减少的变化趋势，复合酶制剂投加量在0.6～1.0 g时还原糖含量的增加趋势相比酶解温度在35～45 ℃及pH为3～5时增加趋势更明显，说明复合酶制剂投加量对还原糖含量的影响强于酶解温度及pH。由图8可知，酶解温度和酶解时间分别在37～50 ℃和4.1～6.7 h范围内，还原糖含量可达最大值。如图9所示，pH为3～5时，还原糖含量呈上升趋势，在pH为5时还原糖含量达最大值，pH大于5后，还原糖含量急速降低；只有在适宜的pH条件下，酶的催化作用才能达到最佳状态，此时酶促反应速度达最大值，从而提高还原糖产率。由图10可知，当酶解温度一定时，还原糖含量随pH的增大呈先增后减趋势；当pH一定时，还原糖含量随酶解温度的升高也呈先增加后减少的变化趋势，而随着酶解温度的升高还原糖含量的变化更加明显，故酶解温度较pH对还原糖含量的影响更显著。

由图5～图10可知，双因素间的交互作用与4个因素对还原糖含量的影响排序基本吻合。

2. 2. 4 响应曲面优化验证结果 选择合适的pH、酶解时间、酶解温度及复合酶制剂投加量可获得较高的还原糖含量，通过Design-Expert v8.0对试验数据进行分析，得出最佳工艺条件为：在复合酶制剂投加量1.0712 g、酶解温度45 ℃、pH 4.87的条件下酶解5.36 h，可获得还原糖含量理论最大值（108.9 mg/g）。考虑到试验过程中的可操作性，将最佳工艺条件修正为：复合酶制剂投加量1.0 g、酶解时间5.4 h、酶解温度45 ℃、pH 5，在修正条件下进行试验，还原糖含量试验值为108.8 mg/g，与理论预测值相差仅0.1 mg/g，说明响应曲面法得出的最优工艺参数具有重现性，且该模型对优化此工艺具有可行性。

3 讨论

近年来，酶解技术在废弃农作物资源化利用中广泛应用。李梦雪等（2013）利用纤维素酶水解紫苏梗，以正交试验优化水解工艺条件，在pH 5.0和纤维素酶投加量720 U的条件下酶解24 h，酶水解率达72.42%。王雪雅等（2013）通过比较纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶及果胶酶4种酶对小麦秸秆的糖化效果，发现小麦秸秆在木聚糖酶的水解作用下还原糖含量最高；通过正交试验得出最优糖化工艺参数，在此工艺条件下，还原糖含量为33.55%，表明小麦秸秆酶解糖化比酸解糖化和碱解糖化的还原糖含量高。马俊洋等（2014）用稀酸对麦秆进行预处理，再进行酶解反应，通过正交试验优化酶解工艺参数，在最优条件下，还原糖含量达707.07 mg/g。本研究利用质量比4∶25∶12的纤维素酶、木聚糖酶和漆酶为复合酶制剂对紫苏梗进行水解糖化，纤维素酶、木聚糖酶和漆酶分别作用于紫苏梗植物组织中的纤维素、半纤维素和木质素，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法优化获得紫苏梗水解糖化的数学模型及适宜参数，最优条件为：复合酶制剂投加量1.0 g、酶解温度45 ℃、酶解时间5.4 h、pH 5，在此条件下，还原糖含量为108.8 mg/g，与理论值仅相差0.1 mg/g，酶解时间较李梦雪等（2013）采用单一纤维素酶水解紫苏梗所需时间缩短18.6 h，酶解温度降低了5 ℃。可见，本研究建立的模型优化紫苏梗水解糖化工艺具有可行性，不仅缩短试验周期，还能节约能源。

本研究探究了各因素对复合酶制剂催化水解紫苏梗组织纤维的影响，结果表明，复合酶制剂投加量对紫苏梗还原糖含量有极显著影响，酶解时间有显著影响，4个因素的二次项均有极显著影响，但两因素间的交互作用对其影响不显著。在研究酶解糖化废弃生物质资源化利用中，任天宝等（2010）、马俊洋等（2014）在酶解之前分别用稀酸预处理稻草秸秆和麦秆，可提高还原糖含量，故预处理方法的选择将作为下一步研究重点。

4 结论

采用响应曲面法优化获得的复合酶制剂催化水解紫苏梗产糖工艺，具有试验周期短、耗能低等优点，建立的数学模型对优化工艺具有可行性，可用于实际预测。

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（責任编辑 罗 丽）