剑麻斑马纹病菌EST—SSR标记开发与评价

吴伟怀　汪涵　汪全伟　习金根　郑金龙　梁艳琼　李锐　黄兴　杨蕊馨　贺春萍　易克贤

摘 要 剑麻斑马纹病是剑麻生产中具有破坏性的一种真菌病害。本研究从GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）中随机下载10 525条寄生疫霉EST序列，经过去冗余处理后得到5 519条无冗余EST。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）软件进行SSR发掘，从中共搜索到199个1～6碱基SSR，其中三核苷酸重复基元类型最多，共鉴定到55个，占SSR总数的27.6%；其次是二核苷酸重复基元类型和单核苷酸重复基元类型，分别鉴定到51和47个，各占所鉴定SSR总数的25.6%和23.6%。进一步分析表明，AG/CT二核苷酸重复基元类型为优势重复类型，占二核苷酸SSR总数的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2个基元类型在三核苷酸中出现频率最多，分别为15和11次，分别占三核苷酸SSR总数的27.3%及20.0%。从鉴定的199个SSR中，选取含有SSR的合适区段设计了22对引物，并通过18个剑麻斑马纹病菌菌株的基因组DNA进行了评价，结果只有其中9对引物能从剑麻斑马纹病菌基因组DNA中有效扩增，其扩增移效率为40.9%。由此表明，利用此方法来开发剑麻斑马纹病菌的分子标记具有可行性，只是存在一个转移效率问题。

关键词 剑麻斑马纹病菌；表达序列标签（EST）；SSR；分子标记

中图分类号 Q78；S563.8 文献标识码 A

Abstract Zebra spot disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica（or Phytophora parasitica var. nicotianae）is the most serious and devastating fungi disease in sisal. In the present study， a total of 5 519 non-redundant P. nicotianae were generated from the 10 525 publicly available EST sequences by CAP3 software， which used to mine potential microsatellites by microsatellite identification tool（MISA）. A total of 199 SRR was found in P. nicotianae expressed-squence tags data. Of the 199 SSR， the most abundant SSR was the tri-nucleotide type， with the SSR numbers being 55， accounting for 27.6%， followed by the di-nucleotide and mono-nucleotide type， with the SSR numbers being 51 and 47， accounting for 25.6% and 23.6%. Among the di -nucleotide repeats， AG/CT was the most motifs and accounted for 76.5%. The AAG/CTT and AGC/CTG was the most motifs in tri-nucleotide， being 15 and 11， accounting for 27.3% and 20.0%， respectively. Further screening to the number of repetitions and motifs relatively large number of SSR among the 199 SRR， which the right position to develop molecular markers， and a total of 22 primers were developed.Among the 22 primer pairs designed and synthesized， there were only 9 primer pairs that amplified characteristic SSR bands in genomic DNA of 18 tested isolates of P. nicotiana from sisal， thus the transferability was 40.9%. The results showed that it is feasible for molecular markers using this method to develop the sisal zebra germs， only a transfer rate of problems.

Key words Phytophora nicotianae var. parasitica / Phytophora parasitica var. nicotianae； expressed sequence tag （EST）； simple sequence repeat（SSR）； molecular marker

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.018

近年來，随着分子生物学与生物技术的飞速发展，SSR分子标记技术已成为研究植物病原真菌遗传变异与检测的重要手段。传统基因组来源的SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）引物的开发需要构建基因组文库、探针杂交和克隆测序等复杂的操作程序。此方法不仅费时、费力，而且开发成本较高[1]。随着表达序列标签（expressed sequence tag，EST）技术的迅速发展，EST数据库为开发SSR标记提供了快速与廉价的途径[2]。与此同时，由于EST的SSR标记开发是基于基因的转录部分，反映了基因的编码部分，可直接体现基因表达信息，从而与功能基因紧密连锁，使得其在近缘物种间具有很高的通用性[3]。正因如此，使得EST-SSR标记已成为当今被广泛利用的分子标记技术之一。目前，该标记已广泛应用到包括卵菌在内的植物病原菌的群体遗传变异、多样性和进化、基因定位等研究中[4-7]。

剑麻斑马纹病是一种严重危害剑麻的主要病害[8]。其病原菌为烟草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica或表示为Phytophora parasitica var. nicotianae）。中国自1970年首次在广东省东方红农场出现此病后，各植麻区都先后不同程度地发生过此病[8，11]。中国剑麻生产以收获叶纤维为主，其主栽品种‘H.11648栽种历史已有50 a，其种植面积达到总种植面积98%以上[12]。由于长期大面积单一种植，导致其抗性明显下降，病虫害不断发生[9]。针对剑麻斑马纹病菌，印度研究者对印度剑麻麻园的斑马纹病病原菌进行分离鉴定，发现致病菌为烟草疫霉的变种（Phytophthora nicotianae Breda var. parasitica）[13]。赵艳龙等[14]对烟草疫霉菌游动孢子接种剑麻方法进行了研究，结果表明刺伤-棉花保湿法接种剑麻叶片，操作简单方便，接种成功率高，是利用游动孢子接种剑麻斑马纹病的最好方法。刘巧莲[15]则采用菌丝生长速率法对13种药剂的抑菌效果进行室内筛选 55%敌克松、70%甲基托布津和68%精甲霜·锰锌的EC50和EC95最小，抑菌效果最好。国内外对剑麻斑马纹病菌研究主要集中在病原菌鉴定、生物学特性以及致病性与防治药剂等方面，而未见关于剑麻斑马纹病菌EST-SSR分子标记方面的报道。为此，本研究拟从GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）随机下载寄生疫霉EST序列，经过去冗余处理后，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）软件进行SSR的查找和分析。在此基础上，于SSR的侧翼区域合适位置设计引物，并通过剑麻斑马纹病菌基因组DNA进行引物真实性验证，最终开发适用用于斑马纹病菌的EST-SSR标记。为后续病原菌遗传变异及其监测提供分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

从GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）下载10 525条寄生疫霉EST序列（截至2014年9月2日）。用Blast软件进行比对，相似度大于80%的就去掉其中一条。EST拼接后从而获得Unigene；然后，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）软件对对聚类后的无冗余EST序列进行SSR搜索。筛索标准是：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸最少重复次分别为20、6、5、4、3和3次。

1.2 方法

1.2.1 剑麻斑马纹病菌菌株及DNA提取 用于本研究的18个剑麻斑马纹病菌分离物采自不同地方与年份，其具体信息详见表1。供试各菌株菌丝体收集与基因组DNA提取参照吴伟怀等的方法[16]。

1.2.2 SSR位点引物设计 利用Primer Premier 5.0软件（http：//redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/primer5.php）于SSR的侧翼区域合适位置设计引物。设计引物时严格按照如下条件进行：复性温度（Tm）55～60 ℃且上下游引物复性温度相差小于3 ℃；预期扩增产物片段大小50～300 bp；引物长度17～23 bp，且不形成二聚体及发夹结构等。设计好的引物最终交由Invitrogen公司采用普通脱盐方式合成。

1.2.3 PCR 扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR反应体系为20 μL，其中包括14.2 ddH2O，1 μL DNA模板（约50 ng/μL），2 μL 10×EasyTaq Buffer，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.2 μL EasyTaq DNA poly。PCR反应在 Mastercycler gradient Mastercycler PCR扩增仪上进行，扩增反应程序为：94 ℃预变性3 min；随后94 ℃变性30 s，55 ℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min，15 ℃保存。扩增产物经6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶于北京六一仪器厂生产的DYY-Ⅱ型垂直板电泳仪及DYC-30型电泳槽中电泳分离（电泳缓冲液1×TBE，电压90 V，时间2 h）。电泳完毕后，银染显色，BIORAD凝胶成像系统拍照记录。

1.2.4 引物的有效性评价 所设计的引物其有效性通过来自于中国不同剑麻栽培区18个剑麻斑马病菌株进行评价。供试引物只要在18个剑麻斑马纹病菌株中的任一个扩增出有效条带即为有效引物，而在18个菌株中扩增出不同DNA大小片段的则记为多态性标记。反之，不能在18个剑麻斑马纹病菌菌株中扩增出任何条带则为无效引物。

2 结果与分析

2.1 寄生疫霉菌EST序列中SSR出现频率与特点

对从GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）下載10 525条寄生疫霉EST序列，经过去冗余处理后获得5 519条无冗余EST，总长度为4.05×106 bp。从中共搜索到199个SSR，分布在186条无冗余的EST上，其发生频率为10.6%（含有SSR的EST与无冗余的EST数之比），SSR平均分布距离为20.4 kb（表2）。其中有13条EST序列中包含1个以上SSR（表2）。在被鉴定到的199个SSR中，单核苷酸、二、三、四、五，以及六核苷酸基元类型SSR分别有47、51、55、5、10和31个，其出现频率依次为23.6%、25.6%、27.6%、2.5%、5.0%以及15.6%（图1）。而在EST-SSR重复次数数量方面，出现频率较高的则是重复数为6、4和7，出现次数分别为40、37、30次（表3）。

2.2 二核苷酸基元组成及其频率

在199个SSR中，其中二，三核苷酸基元类型分布最为普遍，为此对二者核苷酸基元类型及频率做更进一步分析。分析结果表明，在51个二核苷酸基元类型SSR中，共存在AC/GT、AG/CT以及AT/AT等3种核苷酸基元类型，其数量依次为5、39及7个，分别占二核苷酸基元类型SSR总数的9.8%、76.5%以及3.7%。由此可见，AG/CT基元为二核苷酸基元类型SSR中最为丰富基元类型（图2）。

2.3 三核苷酸基元组成及其频率

在55个三核苷酸SSR中共存在10种不同基元类型。具体而言，AAG/CTT和AGC/CTG 2个基元出现次数最多，分别为15和11次，占三核苷酸SSR总数的27.3%及20.0%。其次为AGG/CCT、ACC/GGT、ACG/CGT和AAT/ATT等4种基元类型出现的次数分别为9、6、5和3，占三核苷酸SSR总数的16.4%、10.9%、9.1%和5.5%。相比之下，ACT/AGT、CCG/CGG、AAC/GTT与ATC/ATG等4种基元类型出现次数最低，分别为2、2、1、1次（图3）。

2.4 分子标记开发及有效性验证

由于多态性是判断分子标记可用性的一个重要依据。为此，对所获得的EST-SSR进一步分析，并从中选取了22个位点进行引物设计，共设计出22对引物（表4）。利用所设计的引物分别对来自不同地区的18个剑麻斑马纹病菌进行了扩增评价。结果表明，只有9对引物从剑麻斑马纹病菌DNA中扩增出条带，占所开发总引物数的40.9%。具体而言，PP2F/R、PP7F/R、PP8F/R、PP11F/R、PP15F/R、PP16F/R、PP17F/R、PP19F/R、PP20F/R等9对引物能扩增出有效条带（表4）。其中PP11F/R、PP16F/R、PP20F/R分子标记显示出多态性，而PP20F/R多态性最为丰富（图4）。总而言之，利用NCBI数据库中的寄生疫霉菌EST数据来开发剑麻斑马纹病菌SSR标记具有可行性，不过值得注意的是，存在一个转移效率问题。

3 讨论

斑马纹病是剑麻最为严重的一种真菌病害。了解和监测剑麻斑马纹病原菌的群体动态变化对于病害的防控具有重要意义。传统上病害监测采用鉴别寄主法，但是该方法比较耗时费力。随着分子生物技术的不断发展，产生了多种分子标记技术，从而可以从分子水平上监测病原菌的变化。在这些分子标记技术中，其中SSR标记由于其具有分布广、侧翼序列相对保守、多态性丰富，标记多呈共现性，以及重复性好等优点而广受欢迎。SSR标记开发综合起来有如下3个途径，一是基于基因组序列进行SSR位点发掘；二是利用同源或相关物种SSR信息而开发，通过验证其真实性，从而到达开发SSR的目的；最后则是基于转录组数据库信息进行SSR标记开发。本研究中，通过从NCBI中下载的10 525条寄生疫霉EST，经同源性比对分析后获得的5 519条无冗余的Unigene，最后利用MISA软件进行SSR发掘。结果筛选到1～6碱基SSR199个，分布在186条无冗余的EST上，出现频率为10.6%。其中出现频率由高到低依次为三核苷酸重复基元类型、二核苷酸重复基元类型、单核苷酸重复基元类型以及六碱核苷酸重复基元类型。这与已报道的构巢曲霉菌（Aspergillus niculans）排前三的SSR基元类型（依次为五核苷酸基元类型、六核苷酸、核苷酸类型）具有明显差异[17]。在鉴定的杨树锈菌（Melampsora larici-populina）EST-SSR中，三核苷酸重复基元的数量最多，占全部SSR 的44.70%，为优势重复基序；其次为五核苷酸、四核苷酸、二核苷酸、所含微卫星所占比例分别20.53%、17.72%、17.05%[18]。由此揭示，不同病原菌菌体中SSR类型存在明显差异。更进一步比较表明，SSR优势重复基元类型也因病原菌的不同而存在着明显差异。在本研究中，二核苷酸重复基元类型中，存在AC/GT、AG/CT与AT/AT等3种类型，其中AG/CT为优势类型。而三核苷酸重复基元类型中共存在10种不同基序，其中AAG/CTT、AGC/CTG与AGG/CCT为优势类型。与之相比，尖镰孢（Fusarium oxysporum）EST-SSR以二核苷酸重复基元类型为主，占总SSR的59.78%。二核苷酸重复基元又以AC/GT（0.51%）为主[19]。

利用同源或相关物种SRR信息而开发标记，其转移效率是评价引物开发成功的重要指标。为此，在本研究中利用NCBI数据库中的烟草疫霉菌EST数据所合成的22对引物对18个剑麻斑马纹病菌DNA进行了真实性评价。结果表明，仅9对引物能扩增出条带，占总标记的40.9%。这表明其转移效率为40.9%。相比之下，Zhu等[20]利用大豆疫霉EST序列数据，从中设计了40对SSR引物，结果有33对（82.5%）扩增出SSR特征条带；随后，蔺宇等[4]设计140对EST-SSR引物，并通过用10个大豆疫霉分离物进行PCR 检测，最终共有111引物（79.3%）扩增出SSR 特征条带。而徐静静等则从1 234个含有2～4个碱基重复单元的完全SSR中选出260段设计引物，经10个大豆疫霉分离物基因组DNA检测，有213对（81.9%）擴增出SSR特征条带，其中114（53.5%）对引物扩增出多态性[5]。由此表明，通过不同EST数据来开发病原菌的分子标记，其效率具有明显差异。就本研究而言，虽然所利用数据为寄生疫霉菌与引起剑麻斑马纹病病原菌烟草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica 或表示为Phytophora parasitica var. nicotianae）十分近源，但值得注意的是，即使是同一病原菌在与不同寄主共同进化过程中也可能产生变异[21]。另外，由于受内含子有无差异的影响，一些cDNA序列与相应基因组区域存在着一定差异，从而容易导致所发掘的EST-SSR位点序列不存在于基因组DNA上，继而导致所开发的引物不能进行有效PCR扩增[22]。因此，EST-SSR位点的真实性是需要实验进行验证。

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