石橄榄种子无菌播种和快速繁殖研究

林辉锋 陈昌铭 尚伟 林发壮 夏朝水 周辉明

摘要[目的]建立石橄榄种子无菌播种和快速繁殖技术体系。[方法]以MS为基础培养基，添加不同浓度6-BA、NAA、有机添加物，筛选适宜的诱导、增殖及壮苗生根培养基组合。[结果]以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L为石橄榄种子最佳诱导培养基，14 d可见种子萌动，45 d可分化形成丛生幼苗；以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰子汁50 mL/L为最佳增殖培养基，其增殖倍数可达2.750倍，假鳞茎形成率达24.5%；以1/2MS+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L为最佳壮苗生根培养基，苗高可达3.82 cm，根数1.9条。[结论]该研究为石橄榄野生种质资源保护、快速繁育优质种苗奠定了基础。

关键词石橄榄；无菌播种；组织培养

中图分类号S567文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0161-02

Study on Aseptic Sowing and Rapid Propagation Technology for Pholidota chinensis Lindl. Seed

LIN Huifeng， CHEN Changming， SHANG Wei， ZHOU Huiming* et al（Sanming City Agricultural Science Research Academy，Sanming，Fujian 365051）

Abstract[Objective] To establish a system of aseptic sowing and rapid progagation technology for Pholidota chinensis Lindl..[Method]Different concentrations 6BA， NAA， organic additives were added to MS medium to screen the suitable induction， proliferation and strong seedling and rooting medium. [Result]The proper medium for the seeds induction of P. chinensis Lindl. was MS medium containing 6BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L + coconut juice 50 mL/L， seed germination was observed on 14 days，the differentiation and formation of clusters of seedlings were observed on 45 days；the best multiplication medium was MS medium containing 6BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+coconut juice 50 mL/L，proliferation times 2.750，the pseudobulb formation rate up to 24.5%； the best seedling rooting medium was 1/2MS medium containing NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L，plant length up to 3.82 cm，root number 1.9.[Conclusion]The study laid a foundation for the conservation of wild germplasm resources and rapid breeding of high quality seedling.

Key wordsPholidota chinensis Lindl.；Aseptic sowing；Tissue culture

石橄欖学名石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.），系兰科石仙桃属多年生附生草本植物，在李时珍的《本草纲目》中有详细记载，其具清热养阴、化痰止咳、润肺生津、利湿、消瘀等药用功效，可应用于头痛、眩晕、肺热咳嗽、火郁胃痛、热痹、梦遗、热淋、胃火牙痛、虚火喉痛等症状治疗，由于其药效广泛，人们习称为“仙桃”[1]。其提取物制成的单方制剂——头痛定糖浆，为国家准字号药品，临床上用于治疗神经机能性头痛、脑震荡后遗症，疗效明显，年产值达1 500万元。在民间，石仙桃作为一种药食两用的食材有清疏肺热、肝火，养阴生津的功效，是煲汤的常用材料。药用石橄榄多数为野生资源，而野生石橄榄资源再生缓慢，其种子在自然状况下极难萌发，如依靠分株繁殖，则繁育周期较长，繁殖率极低，远不能满足规模化生产需求，且当前市场上的石橄榄品质参差不齐。利用组织培养方法繁殖石橄榄，可有效地稳定其品性，增加繁殖系数，缩短培育周期，从而弥补石橄榄野生种质资源严重不能满足市场需求的不足，达到对石橄榄野生种质资源保护的目的。

在石橄榄相关的组培快繁上，未见有系统的研究报道，仅王莲辉等[2]以尖叶石仙桃蒴果内的种子为材料研究了尖叶石仙桃的胚培养与快速繁殖，但其选用的尖叶石仙桃产地未描述。福建药用石橄榄以细叶石仙桃和石仙桃为主[3-4]，其组培快繁研究未见报道。笔者以石橄榄种子作为外植体，通过不同有机添加物种类、不同生长调节剂配比、不同基础培养基成分研究，筛选适宜的诱导、增殖及壮苗生根培养基配方，从而缩短快繁周期，以期为石橄榄的产业化栽培提供优质种苗。

1材料与方法

1.1材料

外植体材料为采自于三明市农业科学研究院植物园的成熟未开裂石橄榄蒴果。

1.2方法

1.2.1种子消毒。

用棉花蘸取洗洁精将蒴果表面清洗干净，在自来水下冲洗20 min左右，无菌条件下，72%乙醇处理45 s，无菌水清洗3遍，用0.1%HgCl2浸泡消毒10 min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干。用手术刀将消毒好的蒴果切开，将种子撒到装有无菌水的锥形瓶中，摇匀，每瓶接种1 mL。

1.2.2培养条件。

使用200 mL广口瓶为培养容器（下同），每瓶加入30 mL培养基，培养基均添加蔗糖30 g/L、琼脂粉5 g/L，pH 5.6，培养温度（25±1）℃，光照强度2 000 lx。

1.2.3无菌播种初代诱导培养。

以MS为基本培养基，将用无菌水悬浮稀释消毒后的种子，接种于添加不同激素的MS萌发诱导培养基上，培养基配方为①MS；②MS+椰子汁50 mL/L；③ MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；④MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L；⑤MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥 50 g/L；⑥MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭（AC）1 g/L，观察不同培养基对种子萌发的影响。

1.2.4增殖培养。

以MS添加50 mL/L椰子汁为基础培养基，设置6-BA（0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）和NAA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L）2因素5水平试验，增殖培养60 d后统计植株假鳞茎形成率和种苗增殖倍数。植株假鳞茎形成率=统计时植株带假鳞茎数/统计时植株数×100%；种苗增殖倍数=统计时植株数/接种时种苗数。

1.2.5壮苗生根培养及炼苗移栽。

以1/2MS添加1 g/L AC為基本培养基，添加不同浓度NAA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L），壮苗生根培养30 d，统计苗高、根数。将生根好的植株先放在温室大棚炼苗4 d，揭开瓶盖继续炼苗3 d，洗净培养基，用稀释800倍的甲基硫菌灵浸泡10 min后，移栽于珍珠岩∶沙土=1∶1的基质中，保持空气湿度75%以上，环境温度18～28 ℃。

1.3统计分析方法采用DPS数据处理软件进行统计和分析。

2结果与分析

2.1无菌播种初代诱导培养

石橄榄种子较小，45 d后可形成幼苗。无菌初代培养需散光，培养14 d时，可见种子有绿色萌动，在培养0～21 d时，处理⑥中的种子萌动较好，培养22～45 d时幼苗长势较弱；处理④在培养0～21 d时萌动较为缓慢，培养22～45 d时长势快且好；处理⑤种子萌动无论前期还是后期均表现弱势；处理①和②种子萌动

无论是前期还是后期长势均相当，处理③较之种子萌动长势弱。试验结果表明，以处理④（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L）为石橄榄种子诱导培养基最佳。

2.2石橄榄的增殖培养

将初代诱导培养出的石橄榄种苗接种于各增殖培养基上，结果显示6-BA和NAA对石橄榄增殖影响较大，从石橄榄种苗假鳞茎形成率来看，6号培养基中表现最高（40.6%），但其增殖倍数不高，说明低浓度的NAA能够促进石橄榄假鳞茎的形成。从6-BA和NAA对石橄榄种苗增殖倍数影响来看，在6-BA为1.0 mg/L、NAA为0.1 mg/L时，表现最好，达2.750倍，其假鳞茎形成率虽然只有24.5%，但其形成数与6号培养基上的表现相当。由表1可知，高浓度的6-BA（2.0、4.0 mg/L）和高浓度的NAA（0.4、0.8 mg/L）组合抑制了假磷茎的形成且增殖倍数较低，种苗矮小。研究认为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰子汁50 mL/L为最佳增殖培养基。

2.3石橄榄壮苗生根培养及驯化移栽

由表2可知，相比没有添加NAA的对照，添加NAA对石橄榄生根无显著差异，而对石橄榄壮苗影响上，以低浓度0.1 mg/L为极显著差异。其中以1/2MS+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L为最佳壮苗生根培养基，表现为当带假鳞茎石橄榄植株接种于壮苗生根培养基后，14 d即有新根长出，30 d后生根数可达1.9条，苗高 3.82 cm。炼苗移栽是将生根植株炼苗7 d，用稀释800倍的甲基硫菌灵浸泡10 min后，移栽于珍珠岩∶沙土=1∶1的基质中，保持空气湿度75%以上，环境温度18～28 ℃，成活率

3讨论

石橄榄系兰科石仙桃属多年生附生草本植物，其种子较小，在自然状况下极难萌发，因此种子无菌播种萌发和植株形成研究极为重要。前人在对兰科种子无菌播种和快速繁殖研究上，发现适宜的外源激素添加通过降低其促萌发的内源激素含量引起种子萌发[5]。同时，有机添加物因其富含多种营养成分，具有为植物生长提供一些生理活性物和补充未知微量成分的作用，已有运用于兰科植物的研究[6]。通过研究基础培养基添加外源激素、香蕉泥、椰子汁和活性炭组合发现，椰子汁比香蕉泥更易于石橄榄种子萌发和幼苗形成，同时，结合外源激素添加更能促进石橄榄种子萌动，促进细胞分裂和幼苗分化。虽然活性炭对于石橄榄种子前期的萌动有促进作用，但是后期的幼苗分化能力较为不足，可能是由于活性炭能够提供暗环境和吸附培养基中有害物质（如醌类化合物）的同时，也能吸附离体培养中的生长调节物和一些有益的营养物[7]。

在石橄榄的增殖培养中发现，在基本培养基中添加细胞分裂素6-BA和生长素NAA组合起到关键性作用。适宜浓度的6-BA和低浓度的NAA组合能够促进植物侧芽形成、分化和增殖，这可能是因为石橄榄增殖种苗内源激素较低，需外源添加适宜的植物生长调节剂促进其侧芽的形成、分化和增殖。但当6-BA浓度较高和NAA浓度较高时，都不利于侧芽的形成、分化和增殖，这可能是由于石橄榄增殖种苗在增殖培养过程中吸收并累积过多外源激素所致。因此，石橄榄在侧芽形成、分化和增殖过程中，6-BA和NAA存在交互作用，这与许多植物组织培养报道结果一致[8]。此外，在植物组织培养阶段，假鳞茎的形成有利于植物壮苗生根，进而提高种苗质量和移栽成活率。研究发现低浓度的NAA有利于植株假鳞茎的形成，而高浓度下假鳞茎形成数较少，适宜浓度的6-BA和NAA组合有利于促进植物侧芽形成、分化和增殖以及植株假鳞茎的形成。

该研究以石橄榄种子为外植体，研究不同浓度6-BA、NAA、有机添加物组合，筛选了适宜的诱导、增殖及壮苗生根培养基配方，建立了一套石橄榄种子无菌播种和快速繁殖技术体系，对于石橄榄野生种质资源保护、繁殖周期缩短、供应优质种苗具有重要意义。

参考文献

[1]

翁水旺.石仙桃的研究进展[J].中国现代中药，2006，8（6）：35-36.

[2] 王莲辉，姜运力.尖叶石仙桃的胚培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2006，42（5）：136.

[3] 胡明芳.福建药用兰科植物资源保护与可持续利用[J/OL].（2012-02-27）[2016-10-11].http：//wenku.baidu.com/view/23081cefe009581b6bd9eb50.ht mL.

[4] 易绮斐，邢福武，陈红锋，等.我国石仙桃属植物的分布和开发利用[J].华南农业大学学报，2004，25（3）：94-97.

[5] 周辉明，林辉锋，尚伟，等.垂花蕙兰种子无菌播种和快速繁殖[J].福建农业学报，2013，28（10）：981-986.

[6] 李亮，张冬梅，雷华辉，等.植物组织培养中有机添加物应用研究[J].宁夏农林科技，2012，53（2）：28-30，34.

[7] 刘根林，梁珍海，朱军.活性炭在植物组织培养中的作用概述[J].江苏林业科技，2001，28（5）：46-48.

[8] 黎海利，谭飞理，刘锴栋，等.聚花过路黄的组织培养和快速繁殖[J].江苏农业科学，2015，43（6）：51-53.