泰国斗鱼玈ox9基因的克隆及组织表达研究

贺超 洪广 吴静娴 冯正阳 王文基 陈华谱 朱春华 李广丽

摘要[目的]克隆性别调控基因Sox9的cDNA序列，为后续开展Sox9分子进化及性别调控功能的研究提供参考。[方法]从泰国斗鱼中克隆鉴定出Sox9基因的cDNA序列全长，并展开序列分析及在雌雄个体中的组织分布研究。[结果]利用Smart-RACE的分子克隆方法，从泰国斗鱼精巢中克隆得到Sox9基因的cDNA序列，全长为2 201 bp，其中开放读码框1 449 bp；氨基酸比对分析显示Sox9氨基酸序列中的HMG序列的保守性相当高；通过系统进化树分析发现泰国斗鱼Sox9与半滑舌鳎的亲缘关系最近；利用RT-PCR的方法检验了泰国斗鱼Sox9基因在雌雄个体中的组织分布，结果发现泰国斗鱼Sox9基因在雌性的肌肉中表达量最高，其次在脑和肠中，而在卵巢未检测到表达信号；在雄性中，Sox9基因在脑和精巢中的表达量最高。[结论]泰国斗鱼Sox9具有保守的结构特征，并且在组织分布中显示出表达特异性及性别差异性。

关键词泰国斗鱼；Sox9；序列分析；组织分布

中图分类号S917.4文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0151-05

Study on Cloning and Tissue Expression of Sox9 in Betta splendens

HE Chao，HONG Guang，WU Jingxian，CHEN Huapu* et al（Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA sequence of sexual regulation gene Sox9 ，to provide a basis for the molecular evolution and functional studies of Sox9 in Betta splendens.[Method]The Sox9 cDNA sequence in B.splendens was cloned.Sequence analysis and research of organizations distribution in the male and female individual was carried out.[Result]The Sox9 cDNA sequence in the testis of B.Splendens was cloned by using the rapidamplification of cDNA ends （RACE），it contained 2 201 bp nucleotides with the open reading frame （ORF） of 1 449 bp；the amino acid sequence alignment showed that the HMG （the high mobility group box） domain of Sox9 was rather conserved； based on the phylogenetic analysis，the B.splendens Sox9 protein was closer to Cynoglossus semilaevis；tissue distribution analyzed by RTPCR showed that the expressions of Sox9 were highly expressed in muscle，moderate in brain and gun，and undetectable in ovary in female； high expression level of Sox9 was found in testis and brain in male.[Conclusion]The Sox9 in B.Splendens shows conservative structural characteristics，tissue express specificity and gender differences.

Key wordsBetta splendens；Sox9；Sequence analysis；Tissue distribution

Sox（SRYrelated high mobility group box）家族目前已經被克隆鉴定出30多个成员。Sox家族成员均含有79个高度保守HMG盒（high mobility group box）的结构域，主要是与下游调控基因的DNA结合，成为Sox家族成员的最显著性结构特征[1]。其中Sox9被认为是Sox家族中与性别分化较相关的成员之一[2]，受到了广泛的关注与研究。在哺乳类、鸟类和爬行类的性分化时期，Sox9基因在雄性生殖嵴的表达量急剧上调[3-5]。在小鼠中，雌性性腺中Sox9的异常表达导致了睾丸的形成[6]。Sox9基因的缺失会造成雄性逆转成为雌性，从而表明Sox9基因在精巢发育中起了至关重要的作用，并被认为是雄性性别决定因子[7]。但在后续的研究中发现，在成年小鼠卵巢中，Sox9在卵泡发育过程中同样扮演着重要的调控角色，显示出Sox9在雌雄发育调控中的双重生理功能[8]。

鱼类的性腺发育具有多种形式，如雌雄异体、雌雄同体、先雌后雄和先雄后雌等。鱼类多样化的发育模式为研究性别分化机制提供了更加理想的模型。Sox9作为公认的性别分化调控因子之一，在鱼类研究中同样受到了广泛的关注。目前已经在斑马鱼（Danio rerio） [9]、 鳝鱼（Monopterus albus）[10]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss） [11]、青鳉（Oryzias latipes）[12]、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides） [13]、大西洋鳕鱼（Gadus morhua） [14]、金钱鱼（Scatophagus argus） [15]和胡子鲶 （Clarias batrachus） [16]等鱼类中展开研究，证实Sox9在鱼类性别分化中发挥着重要的作用。但由于鱼类属于低等的脊椎动物，易受外界因子的影响，导致性别的可塑性较高，因此需要在更多的鱼类中进行拓展研究，才能更好地从差异中获得共性结果，从而更好地阐述Sox9基因在鱼类中的性别调控功能。

泰国斗鱼（Betta splendens）原产于泰国，又被称为彩雀鱼，是一种重要的热带小型淡水物种，同时是一种被广泛养殖的观赏鱼。泰国斗鱼雌雄个体差异十分明显，雄性天生好斗，色彩丰富多样，环境适应能力强，价格便宜，易于饲养，是一种研究鱼类生理功能的理想模型。目前对泰国斗鱼的分子生物学研究较少，笔者以泰国斗鱼为研究对象，利用现代分子克隆的技术方法，从泰国斗鱼的精巢中克隆鉴定出Sox9基因的cDNA序列全长，并开展了Sox9基因相关序列的结构分析及组织表达分布研究，为深入阐明Sox9基因在泰国斗鱼中的生理功能奠定了基础。

1材料与方法

1.1试验鱼试验用鱼（泰国斗鱼）购于广东省湛江市霞山区花鸟市场。试验中，将泰国斗鱼置于冰上麻醉，等其失去知觉后，将其肌肉、性腺、脑、垂体、心脏、肝、肾、脾、肠等组织或器官取出，液氮速冻，然后保存于-80 ℃ 超低温冰箱中備用。

1.2试剂

总RNA提取试剂Trizol Reagent购于Life公司； DNase Ⅰ和the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购于TOYOBO公司；Smart-RACE试剂盒购于TaKaRa Clontech公司；Taq酶和载体pTZ7R/T购于MBI Fermentas公司； 质粒提取和胶回收试剂盒购于广州东盛公司；化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.3序列比对与引物设计

通过NCBI 基因库的序列搜索比对，找出与泰国斗鱼Sox9序列同源性最高的鱼类Sox9序列。通过比对分析，根据序列的保守结构，设计出用于泰国斗鱼Sox9基因克隆与组织表达分析等的引物（表1）。

1.4总RNA提取

根据Trizol reagent试剂盒说明书的要

求操作，获得泰国斗鱼各组织的总RNA。总RNA的浓度和完整性分布利用核酸测定仪和琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5分子克隆

以泰国斗鱼精巢的总RNA作为模板，利用the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成克隆Sox9中间片段的cDNA模板，并通过中间片段克隆引物的扩展，克隆获得泰国斗鱼Sox9基因的cDNA中间片段序列。然后根据中间片段，设计5′和3′Race的特异克隆引物。根据Smart-RACE试剂盒的说明书进行克隆，分别获得泰国斗鱼Sox9基因5′和3′端的序列，然后通过拼接，获得cDNA序列全长。最后通过全长特异引物验证，获得确切的Sox9 cDNA序列全长。

1.6序列分析

利用DNAtool6.0软件分析泰国斗鱼Sox9基因的cDNA序列，确定其开放读码框（Open Reading Frame，ORF）并推导氨基酸序列，用 ProtParam 软件预测蛋白分子量及理论等电点等参数。使用Clustalx1.8进行氨基酸序列比对分析，并用MEGA4.0软件构建系统进化树。

1.7组织分布从各个组织的总RNA中吸取1 μg，用DNase Ⅰ将基因组DNA去除，然后根据第一链cDNA合成的说明书合成cDNA模板。利用泰国斗鱼Sox9基因的特异引物与β-actin基因作为内参，进行组织分布的半定量检测。试验所用的反应体系为25 μL，循环条件为 94 ℃预变性4 min；接着94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，40个循环，72 ℃延伸1 min，吸取8 μL PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，用天能Tanon2500R凝胶成像分析系统进行拍照与半定量分析。

2结果与分析

2.1泰国斗鱼Sox9基因的cDNA序列全长

利用DNAStar软件去除载体序列并将其进行拼接，得到泰国斗鱼Sox9完整的cDNA序列。泰国斗鱼Sox9 cDNA全长为2 201 bp，包括 5′非翻译区（5′-UTR）109 bp，3′非翻译区（3′-UTR）554 bp，开放阅读框（ORF）为1 449 bp（图1）。其中在第104～172 aa之间为Sox9 HMG-box，在该盒内存在1个特征性基序AQAARRKL，2个核定位信号 NLS（NLS1：KRPMNAFMVWAQAARRK；NLS2：RRRK）。用 ProtParam 软件预测泰国斗鱼Sox9 蛋白分子量为 52.972 kD，理论等电点为 6.23。

2.2泰国斗鱼Sox9的氨基酸序列比对及同源性分析 将泰国斗鱼Sox9与已知鱼类的Sox9序列进行同源性分析（图2），结果显示泰国斗鱼Sox9蛋白前体和其他鱼类的Sox9蛋白类似，均具有Sox家族的特征性结构。 泰国斗鱼Sox9蛋白前体中的HMG结构域和其他鱼类HMG结构域同源性较高，显示出高度的保守性，只有1个氨基酸残基的差异。另外，在HMG结构域内同样存在1个特征性基序AQAARRKL，以及2个核定位信号NLS1和NLS2。

2.3泰国斗鱼Sox9系统进化树分析

利用邻位相连算法构建泰国斗鱼以及其他脊椎动物Sox9蛋白的系统进化树（图 3），结果显示泰国斗鱼的Sox9蛋白与其他鱼类聚为一簇，其中与半滑舌鳎的亲缘关系最近，其次是尖吻鲈、斜带石斑鱼、金钱鱼和黄鳝等，与鸡、小鼠和人类等高等脊椎动物的亲缘关系较远。

2.4泰国斗鱼Sox9基因的组织分布

利用RT-PCR半定量的方法分析Sox9基因在泰国斗鱼雌雄个体不同组织中的表达情况。在雌性中，Sox9在肌肉中的表达量最高，其次为脑和肠组织，在肾脏和胃检测到较低的表达量，在垂体中检测到微弱的表达信号，在肝脏、卵巢和心脏中均检测不到表达信号。在雄性中，Sox9在脑和精巢中的表达量较高，其次是肾脏和肌肉，在垂体、肝脏、肾脏、心脏和肠中均未检测到表达信号。

3結论与讨论

通过现代分子克隆技术方法，克隆获得泰国斗鱼Sox9基因的cDNA序列全长。通过序列分析，发现泰国斗鱼的Sox9与其他鱼类的Sox9蛋白一样，具有Sox家族成员典型的HMG结构，并且显示出高度的保守性[1]。泰国斗鱼Sox9蛋白与其他鱼类的Sox9蛋白序列长度和大小相似，并均具有Sox9因子其他的重要结构特征，如2段核定位信号序列NLS1和NLS2，及HMG区域中的特征基序（AQAARRKL）[1-2]。这些基序的高度保守，表明了Sox9蛋白在结构进化过程中的保守性，同时也预示着生理功能在进化过程中的保守。

利用邻位相连算法进一步分析泰国斗鱼及其他脊椎动物Sox9蛋白的系统进化关系，结果表明，泰国斗鱼与半滑舌鳎的亲缘关系最近，其次是尖吻鲈、斜带石斑鱼、金钱鱼和黄鳝等鱼类，而与同为鲈形目的罗非鱼和海鲈的亲缘关系比其他目的鱼类还要远，从而显示出Sox9蛋白的系统进化与物种的进化地位不相一致。这可能与鱼类的基因组结构相关。鱼类基因组在进化过程中，经历了3次基因组复制，导致很多基因发生了多亚型化，一般会同时存在2种或几种亚型。已经在多种鱼类中发现了Sox9基因存在2种亚型[9-10，12]，分别是Sox9a和Sox9b。由于多亚型的存在，可能会导致Sox9蛋白在系统进化树构建中聚类发生改变。后续需要在更多物种中拓展研究，将Sox9的各个亚型进行克隆鉴定，才能进一步完善Sox9蛋白分子的系统进化树。

通过RT-PCR的方法检测了泰国斗鱼在雌雄个体中的组织分布情况，结果分析发现泰国斗鱼Sox9基因具有显著的组织表达特异性和雌雄差异性，预示了Sox9具有多种生理调节功能及雌雄功能的差异。泰国斗鱼的组织分布和其他鱼类一样，均具有组织表达特异性及雌雄差异性[9-10，12]。在雌性泰国斗鱼中，Sox9 mRNA在脑中的表达量均较高，与金钱鱼[15]、虹鳟[11]、斜带石斑[13]和鲶鱼的研究相一致，表明Sox9在上游神经系统中的重要生理功能。另外，该研究还发现Sox9基因在精巢中具有高表达，而在卵巢中检测不到表达信号，这与胡子鲶[16]和斑马鱼[17]Sox9a基因的表达情况相一致，从而表明泰国斗鱼Sox9在雄性发育中具有十分重要的作用，并可能和其他物种一样，起到性别决定的作用。后续需要开展更多的研究，进一步阐明泰国斗鱼Sox9基因在性别调控中的确切功能。

该研究从泰国斗鱼中克隆鉴定出Sox9基因的cDNA序列全长，并展开了序列分析及在雌雄个体中的组织分布检测。序列分析结果表明，泰国斗鱼Sox9具有保守的结构特征，并且在组织分布中显示出表达特异性及性别差异性。这为深入探讨Sox9基因的分子进化及生理功能奠定了研究基础。

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