甘蔗花青素转录因子基因ScRS克隆与基因枪转化研究

刘迪　施桂姣　肖乃衍　KhalilFarghama　许跃语　陈平华　张卓　王恒波　高三基　许莉萍　张华

摘 要 花青素不仅是天然色素，而且具有保健功能。花青素转录因子基因对于调控花青素的合成具有关键作用。本研究根据玉米花青素转录因子基因RS序列设计引物，利用同源克隆技术，得到甘蔗花青素转录因子基因ScRS的全长序列；在ScRS序列两端分别添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点，构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScRS，包被微粒载体通过基因枪对甘蔗愈伤组织进行轰击，转化的愈伤组织明显呈紫红色；将紫红色愈伤组织分化培养获得再生甘蔗植株，经PCR检测，获得转ScRS基因阳性植株，初步证实利用克隆的基因转化甘蔗可以使愈伤组织显色。研究结果对于建立新型的遗传转化可视化示踪体系和培育高花青素甘蔗品种具有重要意义。

关键词 甘蔗；花青素转录因子基因；ScRS；基因枪轰击

中图分类号 S566.1 文献标识码 A

Abstract Anthocyanins are not only natural pigments， but also health care ingredients. The anthocyanin transcriptional factor genes play import roles in anthocyanin biosynthesis. In this study， the specific primer was designed according to the sequence of maize anthocyanin transcriptional factor gene RS. The full sequence of putative sugarcane anthocyanin transcription factor gene ScRS was cloned by homology cloning technology. The plant expression vector of pCAMBIA1301-35SN-ScRS was constructed by adding endonuclease sites of KpnⅠ and SalⅠ at the ends of ScRS sequence， which was transformed into sugarcane calli via gene gun bombardment， and the calli bombarded turned purple-red. The calli with purple-red color were selected and regenerated into plants. The PCR results were positive in the transgenic detection of the regenerated sugarcane plants with specific primers of ScRS. The results preliminarily confirmed that the transformation of ScRS gene would make sugarcane calli colorated. Cloning and characterization of anthocyanin transcription factor genes would contribute to develop anthocyanin-rich varieties and establish visual tracing system in genetic transformation.

Key words Sugarcane； anthocyanin transcriptional factor gene； ScRS； microprojectile bombardment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.018

甘蔗是禾本科作物，除制糖外，還可以生产燃料乙醇，是一种重要的化工和能源作物。另外，果蔗除了直接食用还可以用于制作饮料，消暑生津，是深受人们欢迎的水果。据测定，蔗汁还含有多种营养成分，其中含有的微量花青素还具有保健功能[1]。花青素，也被称为花色素、花色苷，是自然界中一类普遍存在的植物源水溶性色素，不仅能使植物呈现丰富多彩的颜色，有利于植物之间的授粉，而且还能够保护植物果实免受紫外线的伤害。前人的研究结果表明，花青素具备很强的抗氧化能力，其抗氧化能力比维生素C高出20多倍，比维生素E高出50多倍。它是自由基的有效清除剂之一，在心血管疾病的预防、免疫活性的调节等方面尤为重要，具有很高的营养价值和保健作用[2]。如何利用基因工程手段来改造花青素相关基因、提高植物花青素的含量已成为热门的研究领域。自然界中的大多数植物包括甘蔗均可合成花青素[3]，但由于转录因子的未激活等原因致使含量很低，通过导入调节基因，使其适当表达，可以改变植物中花青素的含量[4]。目前已有科学研究表明，合理适当地运用花青素调控基因，可以建立一套新型的植物转基因研究可视化示踪系统[5]。当前在遗传转化上应用比较广泛的报告基因如GUS和GFP等都存在着一定程度的不足和缺陷，如GUS染色对植株具有破坏性[6]；GFP蛋白含量较高时对植物具有毒害作用，使细胞再生能力下降[7]。二者除有报告功能外，没有其它实际应用价值；表达的蛋白还要消耗植物同化物，对植物生长无益等。如以花青素转录因子基因作为报告基因，除了可以发挥报告功能外，对植物的生长和人类健康也具有重要作用，因此，对花青素表达相关基因的研究显得尤为重要。

本研究在其他作物研究的基础上，试图在甘蔗中克隆出与花青素合成有关的转录因子基因，并将克隆的基因转化甘蔗愈伤组织，观察显色效果，筛选可引起甘蔗细胞发生颜色变化的基因，旨在评估利用该基因建立遗传转化可视化示踪体系的潜力，同时为培育高花青素品种和创制优良种质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料与试剂 甘蔗品种ROC22和FN39由福建农林大学国家甘蔗工程中心选育；表达载体pCAMBIA1301-35SN由本中心保存；pMD18-T载体、Premix TaqTM（RR902A）、RNA kit ver.3.0购自TAKARA公司；TIANscript RT Kit、DNA Maker、T4 DNA Ligase和DH5α购自北京天根公司；LA Taq酶、2×Premix Ex Taq酶、Pfu DNA聚合酶、内切酶KpnⅠ和SalⅠ购自Fermentas公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（D2500-02）、E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit（D6942-02）购自OMEGA公司；上海生工生物工程公司（下文简称上海生工）合成PCR引物、提供LB培养基、Trizol试剂和DEPC H2O；基因枪耗材购自Bio-Rad公司；植物DNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；卡那霉素、亚精胺、CaCl2·2H2O均购于Sigma公司；甘蔗培养基配方参见张卓等[8]，有关试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 定性PCR检测使用德国Eppendorf公司生产的5331型PCR仪；基因枪使用美国Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He微粒转化系统。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据玉米RS（GenBank：X15806.1）序列，在起始和终止密码子位置设计一对引物，分别为ScRSF1（5′-ATGGCCGTTTCAGCTTCC-3′）、ScRSR1（5′-TCACCGCTTCCCTATAGC-3′）。在引物的两端添加内切酶位点SalⅠ和KpnⅠ，用于构建植物表达载体（ScRSF2：5′-ACGCGTCGACATGGCCGTT

TCAGCTTCC-3′；ScRSR2：5′-GGGGTACCTCACC

GCTTCCCTATAGC-3′）。

1.2.2 甘蔗叶片总RNA的提取 提取方法参照张卓等[8]。用紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。同时取6 μL总RNA，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，检测RNA的完整性。

1.2.3 cDNA第一链的合成 以甘蔗叶片总RNA为模板，使用TIANscript RT Kit试剂盒合成cDNA第一链，反应体系：5 μL总RNA样品，2 μL Super pured NTPs，2 μL Oligo（dT）15 Primer，加ddH2O使总体积达到14.5 μL，混匀离心，70 ℃保温5 min，在冰水中冷却2 min；然后加入5×Reverse Transcriptase Buffer（含DTT）4 μL，RNasin 0.5 μL，TIANSCRIPT M-MLV 1 μL，终体积20.0 μL；混匀、离心，进行如下热循环反应：25 ℃ 10 min；42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min；将反应液稀释至50 μL，于-20 ℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增ScRS目的基因片段 配制50 μL的PCR反应体系，包括30 μL ddH2O、5 μL 10×pfu Buffer、1 μL Pfu DNA Polymerase、5 μL dNTP、2 μL ScRSF1（10 μmol/L）、2 μL ScRSR1（10 μmol/L）、5 μL模板cDNA，混匀、离心，于PCR仪上进行如下热循环反应：94 ℃预变性3 min，25个循环（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min），最后72 ℃延伸10 min，將PCR产物于4 ℃保存。

1.2.5 目的基因片段回收及加尾 用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段；在微量离心管内配制下列反应液：7.5 μL的ScRS基因片段，1 μL的10×Taq DNA聚合酶缓冲液（含MgCL2），0.5 μL的Ex Taq DNA聚合酶，1 μL的dATP，总体积10 μL；于PCR仪上70 ℃温育20 min。此反应液直接用于TA克隆。

1.2.6 ScRS基因片段TA克隆 在离心管中配制下列反应液：2 μL的ScRS基因PCR加尾产物（50 ng/μL），1 μL的pMD18-T vector（50 ng/μL），2 μL的ddH2O，5 μL的Solution I，总体积10 μL；于16 ℃反应60 min，即为连接产物。

1.2.7 转化大肠杆菌及重组子筛选 参照说明将上述克隆质粒转化DH5α感受态细胞，之后吸取150 μL菌液，加40 μL X-gal（20 mg/ml）和16 μL IPTG（50 mg/ml）混匀，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基，37 ℃培养16 h；挑取白色的单菌落，接种于20 mL LB液体培养基（含100 μg/mL Amp），于37 ℃过夜培养；吸取2 mL菌液，离心收集菌体，用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒；吸2 μL重组质粒，分别加入6 μL ddH2O，10 μL 2×ExTaq Mix，ScRSF1（10 μmol/L）和ScRSR1（10 μmol/L）各1 μL；于PCR仪上进行如下热循环反应：94 ℃预变性3 min，30个循环（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），最后72 ℃延伸10 min；将PCR扩增产物送上海生工测序。筛选的重组子命名为pMD18-T-ScRS。

1.2.8 植物表达载体构建 吸2 μL pMD18-T-ScRS质粒，加入6 μL ddH2O，10 μL 2×ExTaq Mix，ScRSF2（10 μmol/L）和ScRSR2（10 μmol/L）各1 μL，于PCR仪上进行如下热循环反应：94 ℃预变性3 min，30个循环（94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），最后72 ℃延伸10 min；将PCR产物电泳，回收目的片段；用SalⅠ和KpnⅠ对回收片段和载体pCAMBIA1301-35SN进行酶切，将酶切产物电泳，回收目的片段；用T4连接酶连接并转化感受态DH5α。重组子筛选参照1.2.7，引物用ScRSF2和ScRSR2，同时用SalⅠ和KpnⅠ进行酶切验证。

1.2.9 基因枪转化和植株再生 基因枪法转化甘蔗愈伤组织和植株再生方法参考张卓等[8]。

1.2.10 转基因甘蔗再生植株PCR检测 以再生植株为样品，利用微量碱裂解方法制备PCR模板[9]，根据表达载体设计结构特异性检测引物，上、下游引物分别在CaMV35S和NOS区，分别为35S-F（5′-GGGATGACGCACAATCCCACTATC-3′）、NOS-R（5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′）。PCR对照甘蔗内参基因为ALS，引物序列为ALS-F（5′-CTCCC

AGTGAAGGTCTTTGCG-3′）、ALS-R（5′-TGCTGGA

ATGTTGAACCCTTT-3′）。反应体系：2×Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，PCR模板2.0 μL，用ddH2O补足至终体积20 μL。PCR反应参数：94 ℃变性3 min；进行30次循环扩增反应（94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min）；72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后，分别取10 μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并将PCR反应产物送上海生工测序。

2 结果与分析

2.1 RNA浓度与完整性

测定结果显示，提取所得的甘蔗叶片总RNA D260/D280为1.95，D260/D230为2.03。经凝胶电泳分离，结果显示，提取的总RNA有3条（28s、18s、5s）明显的条带（图1），且条带较清晰，无明显杂质，可以用于RT-PCR扩增。

2.2 ScRS基因克隆

2.2.1 ScRS基因序列获得 利用设计的用于克隆花青素转录因子基因RS的引物ScRSF1和ScRSR1，以甘蔗叶片cDNA为模板扩增得到一个大约1 700 bp的DNA片段，命名为ScRS基因，如图2所示。

回收纯化扩增效果较好的ROC22 PCR产物，将其与pMD-18T载体连接，用PCR检测阳性克隆并进行测序，得到1 722 bp的序列，见图3。甘蔗ScRS基因开放读码框长度为1 722 bp。将甘蔗ScRS基因的编码区序列在NCBI上进行BLAST分析，结果发现，其与玉米的RS基因（登录号：NM_

001112603.1）序列相似度为90%，与玉米Lc基因（登录号：NM_001111869.1）相似度为82%，与高粱b1-1基因（登录号：AY542311.1）相似度为89%，与玉米b1基因（登录号：NM_001112236.1）相似度为84%，与狗尾草R-S基因（登录号：NM_004970820.1）相似度为83%。特别是在与众多花青素相关基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，说明所克隆的基因为花青素合成相关基因。

2.2.2 ScRS基因氨基酸序列分析 甘蔗ScRS基因开放读码框长1 722 bp，编码573个氨基酸，理论分子量为62.55 ku。其cDNA序列相对应的氨基酸序列如图4所示。通过NCBI进行conserved domains specific BLAST，结果发现在甘蔗ScRS蛋白中含有bHLH-MYC（第11-203氨基酸）和HLH（第382-432氨基酸）结构，这是花青素调控因子的共有特征，进一步证明克隆的基因确实为花青素调控因子基因。

2.3 表达载体构建与酶切验证

通过酶切、目的片段回收和连接等过程，将克隆的ScRS基因插入到载体pCAMBIA1301-35SN中，将重组质粒命名为pCAMBIA1301-35SN-ScRS。用SalⅠ和KpnⅠ酶切，结果显示目的基因已成功整合进重组质粒中（图5）。

2.4 基因枪转化和植株再生

挑取嫩黄色、致密的愈伤组织进行基因枪轰击。轰击4～5 d后，甘蔗愈伤组织表面会出现少许褐色；在诱导培养基上继续培养20 d后，观察到愈伤组织表面颜色发生了明显变化，出现了红色的斑点，而轰击空载体的愈伤组织和未进行基因枪轰击的愈伤组织对照则无明显变化，见图6。

在诱导培养基上培养30 d后，挑选红色愈伤组织于光照条件下进行分化培养，逐渐分化产生了绿苗；经过生根培养和炼苗移栽获得了完整甘蔗苗，观察到大部分再生苗叶片呈绿色（图7-A）。温室移植苗叶鞘部分呈紫红色（图7-B），与对照差别明显。

2.5 转基因甘蔗再生苗的分子检测

取转基因再生苗叶片于1.5 mL离心管中，利用微量碱裂解方法处理叶片[9]，分别获得一定量的DNA模板。首先以甘蔗内参基因ALS为参照基因进行PCR检测，结果见图8，每一个样品在接近200 bp位置均产生了一个条带，与ALS基因目的条带（171 bp）一致，说明碱裂解制备的模板质量能够满足PCR检测的要求，可以进行目的基因的检测。

以红色细胞再生苗叶片碱裂解液为模板，用检测目的基因ScRS表达框的结构特异性引物35S-F和NOS-R进行PCR检测，电泳结果显示在2 000 bp和2 500 bp位置附近各出现了一个条带，结果见图9。

分别将2个条带切下，回收；将回收的PCR产物送上海生工测序，结果显示小片段为目的基因，大片段为GUS基因。由于GUS基因和目的基因两侧的启动子和终止子均为CaMV 35S启动子和NOS终止子，所以PCR检测结果显示有2条带，这与测序结果相一致，说明利用基因枪转化得到了转ScRS基因甘蔗苗。

3 讨论

3.1 ScRS基因在培育高花青素甘蔗中的应用前景

本研究从甘蔗叶片中克隆得到ScRS基因，经过核苷酸和氨基酸序列结构分析，证明该基因是花青素转录因子基因。通过转化进一步证明ScRS基因在甘蔗中具有调节花青素合成的作用。目前，紫心地瓜、猕猴桃等已经进入市场，因天然色素的特殊保健作用使得其价值倍增。但迄今为止，市场上尚未见有紫心甘蔗品种，也尚未见有研究报道。如培育出高花青素的糖料甘蔗品种，则可在加工蔗糖的同时回收花青素，为食品生产提供天然色素，不仅可以消除化学色素添加剂造成的餐桌污染，而且由于花青素的保健作用，將使多种食品成为保健食品；如培育出高花青素的果蔗品种，果蔗的价值将成倍增长，大幅提高蔗农的收入，促进甘蔗行业发展。当然，如果得到的转基因甘蔗ScRS表达量过高，将可能影响转基因甘蔗的其它性状，如产量、蔗糖含量等；因此，需要创制较大的转ScRS基因甘蔗群体，从中筛选ScRS基因表达量适中且其它经济性状变化不大的转基因株系，培育具有推广应用价值的高花青素甘蔗新品种。

3.2 基因槍轰击对甘蔗愈伤组织的影响

基因枪轰击后，对愈伤组织会造成一定的损伤，使得愈伤组织表面发生轻微的褐化现象。Goff[10]等曾报道，枪击时，DNA一般只能达到组织表面细胞的1～5层内，最深的不过12层。本研究显示，显色细胞不是褐化现象，因为对照细胞没有出现褐化，转ScRS基因的愈伤组织出现的是紫红色斑点，显微观察整个细胞呈红色，不显褐色，且显色部位也不在细胞间隙。本研究结果表明，可以通过转入花青素的相关转录因子基因ScRS，对愈伤组织进行有目的的选择，挑取有颜色的组织进行分化，得到转基因植株，ScRS具有作为筛选标记基因的潜力。

3.3 ScRS的调节作用

在类黄酮次生代谢生物合成中，转录因子扮演着重要角色。当转录因子同结构基因结合后，能激活代谢途径中多个基因的协同表达，进而使次生代谢途径能够有效地启动。转录因子在花色合成过程中的空间表达体现了组织特异性和时空差异性。同一合成途径在植物的不同发育阶段，花色素合成受控于不同的转录因子。Eugenio等[11]曾报道将从金鱼草中克隆的转录因子基因Rosea1转入番茄，转基因番茄的果实呈蓝紫色。杨芸菲等[12]将从巨峰葡萄中分离的花青素合成调节基因VlmybA2转入到水稻中，转基因水稻的根际变为红褐色条纹。Han等[13]利用玉米调控基因pl和Lc转化玉米时也得到了相似的结果。本研究中，在甘蔗愈伤组织阶段，愈伤组织表面出现紫红色，而分化成为植株后组织器官较对照并未发生明显的颜色变化，但当其在温室内发育成为较大植株时又出现显著的颜色变化。推测ScRS的调节作用具有时空性，在愈伤组织期间表达显著，增强了代谢途径，使愈伤组织呈现出红色；在愈伤组织发育成为植株的过程中，ScRS的调节作用减弱；植株形成后，ScRS的调节作用又开始显现，使得植株在不同阶段表现出颜色的差异，其机理有待深入研究。

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