复合酶法提取菊芋菊糖的工艺优化

江玉婷 陈靖超 李程程 刘丽萍 汪自慧 杭华

摘要[目的]优化复合酶提取菊芋菊糖的工艺。[方法]探讨料液比、pH、温度、复合酶等对菊芋菊糖提取率的影响，在此基础上，采用响应面分析方法，对其操作参数进行优化，获得最佳的工艺条件。[结果]菊芋菊糖提取的最佳工艺条件：料液比1∶20（g∶mL），pH 6.0，酶解温度 54 ℃，复合酶（m木瓜蛋白酶∶m果胶酶=1∶8）131 μg/g样品，提取时间40 min；在此条件下，菊芋菊糖提取率为73.30%。[结论]该研究可为菊芋菊糖的工业化生产奠定研究基础。

关键词菊芋；菊糖；复合酶法；响应面优化；提取

中图分类号S632.9；R284.2文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0098-05

Optimization of Complex Enzymatic Extraction Technology of Inulin from Jerusalem artichoke

JIANG Yuting， CHEN Jingchao， LI Chengcheng， HANG Hua* et al（Anhui Normal University， Wuhu， Anhui 241002）

Abstract[Objective] To optimize the complex enzymes extraction of inulin from Jerusalem artichoke. [Method] The effects of solidliquid ratio， pH， temperature， enzyme contents on the yield of inulin were explored. On the basis of this， the response surface methodology was adopted to optimize operation parameters and obtain the best extraction conditions. [Result] The results showed that the optimum conditions were the radio of materialtoliquid of 1∶20 （g∶mL）， pH 6.0， temperature of 54 ℃， compound enzymes（mpapain∶mpectinase=1∶8） with enzyme sample of 131 μg/g and extraction time of 40 mins. Under the optimum conditions， the inulin yield could obtain about 73.30%. [Conclusion] The study will provide the thesis basis for further industrial production.

Key wordsJerusalem artichoke；Inulin；Compound enzymatic method；Response surface analysis； Extraction

菊芋（Jerusalem artichoke）别名洋姜、鬼子姜，属于菊科向日葵属，是一种多年生宿根性的草本植物[1]。新鲜菊芋块茎质地细致、微甜脆嫩，具有去湿、益胃、清热解毒的功效，是一种可防治糖尿病和肥胖症的保健食品原料[2]。菊芋块根中含有的植物多糖——菊糖可溶于热水成为胶体溶液，酶能水解菊糖生成单糖。

菊糖是一种天然的碳水化合物，具有甜味但不被人体消化吸收，其是由呋喃构型的D-果糖通过β-（2，1）糖苷键聚合形成的果聚糖混合物，聚合度（DP）为2～60，分子量为3 500～5 500 D[3]。菊糖可作为肠道双歧杆菌的增殖因子，能改善肠道功能[4]，提高人体抗病力并且能有效降低体内致癌化合物含量[5]。菊糖因具有非胰岛素依赖性，摄入人体后血糖含量不会升高，非常适合添加于糖尿病人的食品中[6-7]。因此，近年来有关菊芋菊糖提取和应用的研究受到了广泛的关注。

目前，菊糖主要是从菊芋中提取得到[8]。菊糖的提取方法主要有水浴浸提法[9]、微波辅助水浴浸提法[10]、超声波辅助水浴浸提法[11]。复合酶法与传统的水浴浸提法相比有提取条件温和、节约能源、污染小、操作简便等优点，具有较好的应用前景。然而，目前关于复合酶辅助提取菊芋菊糖的研究相对较少。笔者采用复合酶辅助水浴浸提法提取菊芋菊糖，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法进行工艺参数优化，为从菊芋中提取菊糖的工业化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试药材。新鲜菊芋，购于安徽芜湖，经干燥后粉碎备用。

1.1.2主要试剂。果胶酶（酶活力100 000 U/g），木瓜蛋白酶（酶活力800 000 U/g）；蒽酮、硫脲、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、浓硫酸、氢氧化钠、丙三醇及其他试剂均为分析纯。

1.1.3主要儀器。DHG-9101-3S型电热恒温鼓风干燥箱，金坛市杰瑞尔电器有限公司；HH-S型恒温水浴锅，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；SHZ-D（Ш）型循环水式真空泵，南京科尔仪器设备有限公司；756型紫外可见分光光度计，北京博晖创新光电技术股份有限公司；PHS-3C 型pH计，上海雷磁仪器厂；80目筛，北京祥宇伟业仪器设备有限公司。

1.2方法

1.2.1菊芋菊糖的提取工艺流程。菊芋→切片→干燥→粉碎→过筛→称量样品→复合酶提取→90 ℃灭酶10 min→过滤→保留上清液（提取液）。

1.2.2可溶性总糖含量的测定。采用蒽酮比色法在波长为620 nm处测定吸光值，代入葡萄糖标准曲线（回归方程y=0.113 2 x+0.002，R2=0.995 4），求出总糖质量，按下述公式计算菊芋中可溶性总糖含量。

可溶性总糖含量（%）=C×V总×DW×V测×106×100%

式中，C为标准曲线中得到的糖含量（μg）；V总为提取液的总体积（mL）；V测为测定时使用液体体积（mL）；D为稀释倍数；W为样品质量（g）。

1.2.3还原糖含量的测定。以葡萄糖为标准，采用DNS比色法在波长为540 nm处测定吸光值，代入葡萄糖标准曲线（回归方程y=6.784 9x+0.086，R2=0.999 3），计算出还原糖质量，按下述公式计算出菊芋中还原糖的含量。

还原糖含量（%）=m还原糖质量m样品×100%

1.2.4复合酶比例的筛选。使用分析天平称取木瓜蛋白酶和果胶酶，按照质量比为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12制成0.1 mg/mL的复合酶酶解液，取上清液存放于冰箱中。称取多份1.000 0 g样品，加入2 mL上述酶解液后，再加入2 mL蒸馏水，在温度55 ℃的条件下浸提50 min，根据下述公式计算菊糖的提取率。

菊糖得率（%）=m总糖-m还原糖m样品×100%

1.2.5单因素试验。

1.2.5.1料液比对菊糖提取率的影响。在复合酶为80 μg/g、pH 5.5、温度50 ℃和提取时间40 min条件下，选择料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）进行试验，探究料液比对菊芋中菊糖提取率的影响。

1.2.5.2pH对菊糖提取率的影响。在复合酶为80 μg/g、料液比为1∶20、温度50 ℃和提取时间40 min条件下，选择pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0进行试验，探究pH对菊芋中菊糖提取率的影响。

1.2.5.3温度对菊糖提取率的影响。在复合酶为80 μg/g、料液比为1∶20、pH 6.0和提取时间40 min条件下，选择温度分别为45、50、55、60、65 ℃进行试验，探究温度对菊芋中菊糖提取率的影响。

1.2.5.4复合酶对菊糖提取率的影响。在温度55 ℃、料液比为1∶20、pH 6.0和提取时间40 min条件下，选择复合酶分别为0、40、80、120、160 μg/g进行试验，探究复合酶对菊芋中菊糖提取率的影响。

1.2.5.5提取时间对菊糖提取率影响。在温度55 ℃、料液比为1∶20、pH 6.0和复合酶为80 μg/g条件下，选择提取时间分别为30、40、50、60、70 min进行试验，探究提取时间对菊芋中菊糖提取率的影响。

1.2.6响应面试验设计。由于温度和pH对酶活性影响很大，会对菊芋中菊糖的提取率产生直接影响。结合单因素试验的结果，以温度、复合酶用量和pH 3个因素为自变量，采用BoxBehnken中心组合试验，进行响应面优化试验。试验因素与水平设计见表1。

2结果与分析

2.1复合酶比例筛选

可以看出，当木瓜蛋白酶∶纤维素酶质量比为1∶8时，菊糖的提取率最高。当质量比为1∶10和1∶12时，菊糖的提取率降低，原因可能是当果胶酶的浓度升高到一定数值时，使得复合酶的酶活性下降[12]，对菊芋细胞壁的破坏力降低，导致菊糖的提取率降低。因此，复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）质量比应为1∶8。

图1复合酶酶解效果比较

Fig.1Comparison of the effects of complex enzymatic hydrolysis

2.2單因素试验

2.2.1料液比。从图2可知，随着料液比中溶剂用量的增加，菊糖的提取率呈现先上升后下降的趋势，当料液比为1∶20（g∶mL）时，菊糖的提取率最高。原因是料液比中溶剂用量增加，溶液中的底物浓度和复合酶的浓度因此下降，有效反应碰撞减少。

2.2.2pH。从图3可知，当pH 6.0时，菊糖的提取率最高；当pH<6.0时，随着pH的升高，菊糖的提取率也随之增加；当pH>6.0时，随着pH的升高，菊芋中菊糖的提取率随之下降。原因是pH 6.0时，可能是复合酶的最适pH，酶在最适 pH 范围内表现出活性，大于或小于最适 pH，都会通过改变底物和酶的带点状态，从而影响酶和底物的结合[13]。pH超过一定范围会影响酶的稳定性，过高过低都会使酶受到不可逆伤害。

2.2.3温度。从图4可知，当温度低于55 ℃时，菊糖的提取率随温度的升高而上升；在温度为55 ℃时，菊糖的提取率达到最大；当温度高于55 ℃时，菊糖的提取率随温度的升高而下降。原因是温度上升，反应物的活化能增加，使酶解速度变快，而当超过最适温度后，反应速率会显著下降，这是由于温度过高使蛋白质变性导致其活性降低甚至失活，反应速率也会随着温度升高而下降。当温度过高时可能会使酶失去活性，最后提取得到的菊糖完全是水浴浸提法得到的，与酶解无关。

2.2.4复合酶用量。从图5可知，当复合酶的添加量增加时，菊糖提取率会上升。当复合酶的添加量达到120 μg/g后，菊糖提取率的增加幅度会显著减少。原因是添加复合酶的量达到饱和，此后，增加酶的添加量，菊糖提取率会下降。考虑实际生产中的成本问题，复合酶的最佳添加量为120 μg/g。

2.2.5提取时间。从图6可知，水浴浸提时间为40 min时，菊糖提取率达到最大；当水浴浸提时间小于40 min时，随着提取时间的增加，菊糖提取率增大；当水浴浸提时间大于40 min时，菊糖的提取率变化幅度不大。原因可能是水浴浸提时间较短，导致反应时间不够，酶解的程度不够充分，而当复合酶浓度达一定量，酶促反应时间的增加并不能显著增加菊糖的提取率。

安徽农业科学2017年

2.3响应面优化试验

2.3.1响应面设计及结果。

采用DesignExpert V8.0.6软件对试验数据进行回归分析。在单因素试验的基础上，以菊糖提取率为响应值，利用BoxBehnken 响应面法设计3因素3水平试验，共17个试验点，其中12个析因点，自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点； 5个零点为区域的中心点，用来估量试验的误差。 菊糖提取率见表2。

2.3.2模型的建立及其显著性检验。

采用DesignExpert.V8.0.6软件对表2的试验数据进行分析，得到菊糖提取率和温度（A）、复合酶（B）、pH（C）的二次多项回归模型为：菊糖提取用显著的是A、C，极显著的是B、A2、B2、C2。可见，各因素对菊芋中菊糖提取率的影响并不是单纯的线性关系。

对回归模型进行方差分析显示，该回归模型的P<0.000 1，表明回归方程模型极显著；失拟项P=0.190 1>0.05，表示失拟不显著。模型的相关系数R2=0.996 6，调整确定系数R2Adj=0.992 3，说明该模型能够解释99.23%响应值的变化，即该数学模型与实际试验拟合程度良好，试验误差小，用该模型分析和预测菊芋中菊糖的提取是合适的。

2.3.3响应面分析与工艺优化。为确定温度、复合酶、pH这3个因素及其交互作用对菊芋中菊糖提取率的影响， 根据回归方程绘出响应面及等高线图。响应面越陡峭，各因素之间的交互作用越强烈；响应面越平缓，各因素之间的交互作用越弱。等高线的形状呈现为椭圆形，则表明两因素之间的交互作用较大，若等高线的形状呈现为圆形，则表明两因素之间的交互作用较小。各两因素之间的交互作用响应面和等高线见图7～9。

可见，温度和复合酶用量的相互关系显著。在低温区，提取时间对菊芋中菊糖提取率影响较明显。最初菊糖的提取率会随温度升高而升高，而后提取温度的升高反而会导致菊糖提取率的下降。由图8可见，温度和pH相互关系不十分显著，菊糖提取率随温度的升高和pH的增大都呈现先上升后下降的趋势。由图9可见，复合酶用量和pH相互关系十分不显著，菊糖提取率随复合酶用量的增加而增加，只是起初升高较快，随后比较缓慢，直至逐渐趋于平缓。随着pH的加大菊糖提取率的趋势为先上升后下降。

2.3.4最佳工艺条件确定和回归模型的验证试验。

应用DesignExpert V8.0.6软件，采用BoxBehnken建立了温度（A）、复合酶用量（B）、pH（C）与菊糖提取率之间的数学模型，即菊糖提取率=72.60-1.78A+6.57B+1.79C-7.15A2-11.19B2-5.08C2。 回归分析表明，相关系数R2=0.996 6，回归模型极显著，拟合程度好，有实际应用意义。 通过显著性检验，各因素的影响排序从大到小依次复合酶用量（B）、pH（C）、温度（A）。当响应面值最大时，A、B、C对应的编码值分别为-0.120、0.296、0.197，与之对应的菊芋菊糖的复合酶辅助提取最佳工艺条件为温度54.40 ℃ ，复合酶用量131.84 μg/g，pH 6.1。此时，菊芋中菊糖的理论提取率达 73.86%。为检验响应面的可靠性，使用最优提取工艺条件做菊芋菊糖的复合酶辅助提取菊糖的验证试验。 同时考虑到实际操作中的局限性， 将工艺参数修正为复合酶用量131 μg/g，温度54 ℃，pH 6.0，在此修正条件下做3次平行验证试验，测得菊糖提取率分别为73.29%、73.36%、73.34%，平均菊糖提取率为73.30%，与理论预测值73.86%基本吻合， 说明采用响应面优化得到的提取条件准确可靠，可为进一步大规模生产提供理论依据。

3结论

该研究在单因素试验的基础上，通过BoxBehnken 中心组合设计以及响应曲面分析法对菊糖的提取工艺进行了优化，得到最佳提取工艺条件为料液比1∶20（g∶mL）、pH 6.0、温度 54 ℃、复合酶（m木瓜蛋白酶∶m果胶酶=1∶8） 用量131 μg/g、

时间 40 min，在此条件下，菊糖得率为 73.30%。

该试验采用木瓜蛋白酶和果胶酶的复合酶对菊芋浸提液进行处理，能够有效地对菊芋细胞进行破壁，使糖类物质易于溶出，提高了菊芋中菊糖的溶出速度，从而减少了提取时间。对比传统方法[14]，该方法使菊糖提取率提高，并且显著降低了提取时间和温度，还可以降低能耗，具有工业化生产应用前景。该试验采用游离复合酶对菊芋菊糖进行浸提，若采用固定化酶可使复合酶反复利用，对降低复合酶的应用成本更为有利。

参考文献

[1]

孔涛，吴祥云.菊芋中菊糖提取及果糖制備研究进展[J].食品工业科技，2013，34（18）：375-378，382.

[2] LIU Z X，HAN L P，YOSEF S，et al.Genetic variation and yield performance of Jerusalem artichoke germplasm collected in China[J].Agricultural sciences in China，2011，10（5）：668-678.

[3] 殷洪，林学进.菊粉、低聚果糖的研究进展[J].中国食品添加剂，2008（3）：97-101.

[4] 侯东军，曾凡坤.菊粉低聚糖生产的研究进展[J].广州食品工业科技，2002，19（1）：41-43.

[5] ROCHA J R，CATANA R，FERREIRA B S，et al.Design and characterisation of an enzyme system for inulin hydrolysis[J].Food chemistry，2006，95（1）：77-82.

[6] 范三红，李静，王亚云，等.超声波辅助复合酶提取菊糖工艺优化[J].食品科学，2015，36（4）：23-28.

[7] 熊政委，董全.菊糖的生理功能和在食品中应用的研究进展[J].食品工业科技，2012，33（20）：351-354.

[8] 李雪雁，陈晓前，王玉丽.果胶酶浸提菊芋菊糖的研究[J].食品工业科技，2009，30（11）：223-225.

[9] 姜少娟.菊芋菊糖的提取研究[J].广州化工，2012，40（23）：82-84.

[10] 贾若凌.微波法提取菊芋中菊糖的工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40（23）：11568-11570.

[11] 罗登林，袁海丽，曾小宇，等.超声强化提取菊芋中菊糖的研究[J].中国食品添加剂，2010（5）：107-112.

[12] VILKHU K，MAWSON R，SIMONS L，et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry：A review[J].Innovative food science and emerging technologies，2008，9（2）：161-169.

[13] 赵玉红，赵小旭，姜晓青.超声波-双酶法协同提取林蛙皮多糖的工艺优化[J].食品工业科技，2012，33（11）：230-234.

[14] 张泽生，张建平，王浩，等.菊芋菊糖的超声波提取、纯化及HPLC法纯度检测[J].食品工业科技，2009，30（6）：260-262.