参附注射液对家兔心肺复苏后心肌细胞凋亡基因caspase—3的影响

苏天生　罗继红　卢静

[摘要] 目的 探讨参附注射液（SF）对家兔缺氧型心跳骤停-心肺复苏（CA-CPR）模型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的影响。 方法 普通家兔18只，采用随机数字表法随机分为SF组、对照组和生理盐水（NS）组，每组6只。除对照组外，制作缺氧型CA-CPR模型。SF组给予参附注射液2.1 mL/kg（生理盐水稀释至5 mL），对照组、NS组予生理盐水5 mL，分别在复苏后分3次每隔10 min缓慢注射。三组用药后采用RT-PCR法检测caspase-3 mRNA表达。 结果 与对照组比较，SF组和NS组caspase-3 mRNA表达增加（P<0.01）；与NS组比较，SF组caspase-3 mRNA表达减少（P<0.01）。 结论 SF对CPR后心肌细胞凋亡基因caspase-3活性有抑制作用。

[关键词] 参附注射液；心跳骤停；心肺复苏；心肌细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0018-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of Shenfu injection（SF） on caspase-3 in hypoxic cardioplegia-cardiopulmonary resuscitation （CA-CPR） in rabbits. Methods A total of 18 normal rabbits were randomly divided into SF group， control group and NS group by random number table method， 6 rabbits in each group. The hypoxic CA-CPR model was made except the control group. SF group was given 2.1 mL/kg of Shenfu injection（diluted by 5 mL of saline）， control group， NS group were treated by 5 mL saline， respectively， after recovery in three times every 10 min slow injection. The expression of caspase-3 mRNA in the three groups was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results The expression of caspase-3 mRNA in SF group and NS group was increased compared with the control group（P<0.01）. The expression of caspase-3 mRNA in SF group was decreased compared with NS group（P<0.01）. Conclusion SF has inhibitory effect on the activity of cardiomyocyte apoptosis gene caspase-3 after CPR.

[Key words] Shenfu injection； Cardiac arrest； Cardiopulmonary resuscitation； Cardiomyocyte apoptosis； Caspase-3

心跳驟停（cardiac arrest，CA）是常见急危重症，心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）过程中心肌缺血再灌注（I/R）后会引起心功能损伤，其中心肌细胞凋亡起着重要作用。心肌缺血再灌注时对心肌细胞的损伤较为严重，不仅能够导致大量心肌细胞凋亡，同时也会由于缺血缺氧状态导致心肌损伤，造成心功能损伤，甚至很可能会再次发生心肌梗死或者心跳骤停，对心肺复苏患者的心脏功能和生命质量均造成严重的影响。现代研究表明，参附注射液（SF）对心肌缺血再灌注有重要的保护作用[1-4]。但是关于SF对心跳骤停心肺复苏患者心功能保护的作用机制研究尚未完全明确，尤其是保护作用机制仍待进一步研究证实。鉴于此，本研究通过研究SF对CPR后家兔心肌细胞凋亡基因caspase-3的影响，为SF在心肺复苏中的临床应用提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

动物：普通级家兔18只，体重约2～3 kg，雌雄不拘，由福建中医药大学动物中心提供[动物合格证号：（闽检证字）第2013A001号]。器材：美国惠普公司心电监护仪；有创动脉血压压力转换器；手提呼吸机。药品：参附注射液[雅安三九药业有限公司，批号：050809，每毫升含0.5 mg人参皂甙（C54H92O23），0.1 mg乌头碱（C34H47NO11）]。试剂：caspase-3抗体（兔多克隆抗体，武汉博士德）。

1.2 模型制作、标本采集与检测

将家兔随机分为SF组、对照组、NS组，每组6只。除对照组外，制作缺氧型CA-CPR模型[5]，经耳缘静脉注射戊巴比妥钠（3%）麻醉，行颈总动脉置管术以监测平均动脉压，再行气管切开置管术以夹闭气管窒息复制缺氧CA-CPR模型；实验全程心电监护。SF组于复苏成功后，分3次注射，每隔10 min以2.1 mL/kg浓度的参附注射液用NS稀释至5 mL经颈外静脉缓慢注射；对照组、NS组用NS 5 mL颈外静脉注射；以心跳恢复4 h计算存活率，实验结束后，取新鲜的心肌组织50 mg机械破碎，待用。

将待检样品中加入浓度为0.25%胰蛋白酶进行消化，温度为37℃，将细胞收集后均匀吸出上层，反复操作5～6次。将混悬液进行离心处理，时间为10 min，转速为2000 r/min。采用DMEM洗涤后再次将混悬液进行离心处理，时间为10 min，转速同上。将上清液撇去后向其中加入浓度为20%的胎牛血清，并且在培养基中制作细胞悬液。在培养瓶中充入95%的空气以及5%的二氧化碳，将经过上述步骤处理的细胞孵育，时间为90 min。完成该项操作后将含有心肌细胞的培养液进行转移处理，在另一个培养瓶中继续进行培养，前72 h内需要向其中加入浓度为0.1 mmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶，能够抑制非心肌细胞的增殖和分化。

根据caspase-3试剂盒操作，计算得到各组caspase-3 mRNA的相对含量。方法为RT-PCR（实时PCR扩增试验），操作如下：首先提取总RNA，将抽提的总RNA按照模板进行合成。引物设计由深圳晶美生物工程有限公司完成并合成，然后配置20 μL PCR反应液，在95℃条件下热启动5 min，然后在95℃条件下水浴20 s，58℃条件下水浴20 s，72℃条件下水浴20 s，共进行40个循环后将扩增的目的基因与对照基因完成对比。利用Ct值对caspase-3 mRNA的表达进行定量。同组中每个样本目的基因测得的Ct值与对照基因中的Ct值之间的差异记为△Ct值，然后将处理组的△Ct值与对照组的△Ct值相减，得出△△Ct值，将其代入计算式2-△△Ct中即刻求出对照组PCR浓度条件下的对照值，将其用以表示caspase-3 mRNA的相对表达量。在该实验过程中内参为β-actin，可以借此完成定量检测和分析。

1.3 统计学处理

采用 SPSS17.0统计学软件进行数据处理。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两组间比较采用t检验，以P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

SF组心跳恢复维持至4 h，4 h存活率100%，NS组复苏失败1只，4 h成功率83.33%。各组家兔心肌caspase-3 mRNA表达的变化见表1。三组caspase-3 mRNA相对表达量比较差异有显著性（P<0.01），与对照组比较，SF组、NS组caspase-3 mRNA表达增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与NS组比较，SF组caspase-3 mRNA表达减少，差异有高度统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

心肺復苏后心肌缺血再灌注损伤病因复杂，大量研究表明心肌细胞凋亡是其中一个重要原因。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成员，是参与凋亡的关键因子，激活后可引起细胞凋亡，降低其活性可抑制细胞凋亡[6-7]。caspase-3是细胞凋亡的主要因子，是关键性蛋白酶切，使之激活或灭活，其水解底物分别参与DNA修复、mRNA降解和细胞骨架的重建等[8-9]。Condorelli G等[10]发现在心肌缺血-再灌注模型中，caspase-3转基因大鼠的心肌梗死面积较大，更易因心力衰竭死亡。

本研究应用的参附注射液[11]是据明代薛己著作《正体类要》中的参附汤制成的中药静脉注射剂，由人参、附子两味中药的提取物混合而成，参附注射液对循环系统有显著的作用，有较好的升压、扩张血管、改善微循环、防治全身多器官缺血再灌注损伤的作用。目前参附注射液已广泛应用于临床急危重症抢救，其对心肺复苏后多器官的保护作用越来越受到重视。已有研究表明，参附注射液对心肺复苏模型大鼠的心脏功能具有较好的改善作用，并可减轻其机体氧化应激状态和心肌损伤，抑制心肌细胞凋亡[12]。本实验通过建立心肺复苏家兔模型，观察复苏成功后心肌细胞凋亡的发生情况，并以参附注射液干预治疗，探讨益气回阳救逆法对心肺复苏后心肌细胞保护的作用机制，为临床诊治提供实验依据。

在心肌梗死再灌注损伤患者中应用参附注射液辅助治疗较单纯常规西药治疗比较，不仅能够有效改善心脏功能和生活质量，对促进快速康复也有积极且重要的意义[13-14]。研究显示[15]，参附注射液对实验大鼠心肌损伤再灌注过程中心肌细胞的保护作用显著，能够有效减少心肌细胞凋亡，进而起到良好的保护实验动物心功能的目的，推测SF注射液可能对心肌梗死再灌注损伤患者的心功能有良好的保护作用，并且与改善心肌细胞凋亡状态有密切的关系。本研究结果中，对照组、SF组和NS组caspase-3 mRNA相对表达量组间差异有显著性，其中SF组、NS组caspase-3 mRNA相对表达量均显著高于对照组，表明心跳骤停后心肺复苏会促进家兔心肌细胞凋亡基因caspase-3 mRNA表达，但SF组caspase-3 mRNA相对表达量远远低于NS组，说明SF注射液能够通过抑制caspase-3 mRNA的表达，进而降低caspase-3蛋白的表达水平，从而达到理想的抑制细胞凋亡状态的目的，实现良好的心功能保护作用。由此可知，参附注射液对心肺复苏患者心功能的保护作用很有可能与抑制caspase-3 mRNA表达、降低caspase-3蛋白有关。本研究结果与既往相关研究结论一致[16]，共同证实了参附注射液对心肺复苏患者心肌梗死再灌注损伤过程中心功能的保护作用。

综上所述，本研究结果表明参附注射液具有抑制促凋亡基因caspase-3活性的作用，其可能是参附注射液抑制CPR期间家兔心肌细胞凋亡作用机制之一。本研究还不够深入，有待进一步研究。

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（收稿日期：2016-09-18）