自体外周血干细胞移植对乙型肝炎肝硬化失代偿期吲哚氰绿滞留率的影响分析

邓勤智　胡耀仁　应豪

[摘要] 目的 观察自体外周血干细胞移植治疗对乙型肝炎肝硬化失代偿期患者吲哚氰绿滞留率的影响。 方法 采用前瞻性、随机对照分组法，将60例乙型肝炎肝硬化失代偿期患者分成两组，每组30例，一组为移植组，在接受综合内科治疗的基础上接受自体外周血干细胞移植治疗，一组对照组，仅接受综合内科治疗。观察自体外周血干细胞移植后12周、24周、36周、48周症状和体征变化、血总胆红素（TBil）、凝血酶原活动度（PTA）、白蛋白（Alb）水平、吲哚氰绿15 min滞留率（ICG R15）的变化以及移植后的副反应、肿瘤发生率等，并与移植治疗前及同期对照组比较。 结果 外周血干细胞移植治疗后，大多数患者腹水等症状改善，未出现严重不良反應；移植后24周、36周、48周Alb水平、PTA与移植前及对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01），移植后36周、48周ICG R15与移植前及12周比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 自体外周血干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化失代偿期患者安全、有效。

[关键词] 外周血干细胞；肝硬化；ICG R15；细胞移植；乙型肝炎

[中图分类号] R657.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0001-04

[Abstract] Objective To observe the effect of autologous peripheral blood stem cell transplantation on the retention rate of indocyanine green in hepatitis B patients with cirrhosis in their decompensation period. Methods Sixty hepatitis B patients with cirrhosis in their decompensation period were divided into two groups according to the method of prospective， randomized， controlled grouping， with 30 cases in each group. One group was transplantation group and received autologous peripheral blood stem cell transplantation on the basis of comprehensive medical treatment. The other was control group and only received comprehensive medical treatment. Changes of symptoms and signs， serum total bilirubin （TBil）， prothrombin activity （PTA）， albumin（Alb） level， the changes of 15 min indocyanine green retention rate （ICG R15）， side effects after transplantation and tumor incidence were observed and compared with the control group and before transplantation at 12 weeks， 24 weeks， 36 weeks and 48 weeks after autologous peripheral blood stem cell transplantation. Results After peripheral blood stem cell transplantation， ascites and other symptoms of most patients were improved and no serious adverse reactions existed. The levels of Alb and PTA at 24 weeks， 36 weeks and 48 weeks after transplantation were statistically significant compared with those before transplantation and the control group（P<0.01）； and ICG R15 at 36 weeks and 48 weeks after transplantation was statistically significant compared with that before transplantation and 12 weeks（P<0.05）. Conclusion Autologous peripheral blood stem cell transplantation in the treatment of hepatitis B patients with cirrhosis in their decompensation period is safe and effective.

[Key words] Peripheral blood stem cell； Cirrhosis； ICG R15； Cell transplantation； Hepatitis B

目前内科治疗乙型肝炎肝硬化失代偿期效果欠佳，肝移植为较理想的治疗方法，但由于供体的紧缺限制了其临床应用[1]。近年来，干细胞移植治疗肝硬化的研究在国内外开展，但目前仍然缺少大样本的随机、对照研究[2，3]，所以亟需一些大样本、随访时间较长的对照研究来进一步证实干细胞移植对肝硬化治疗的意义。我们希望通过本研究了解自体外周血干细胞（autologous peripheral blood stem cell，APBSC）在治疗乙型肝炎肝硬化失代偿期患者中的安全性、疗效，特别是吲哚氰绿（indocyanine green，ICG）滞留率的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择在宁波市第二医院肝病科2011年7月～2013年12月住院的乙型肝炎肝硬化失代偿期患者60例，年龄18～59周岁，诊断标准依据2000年《病毒性肝炎防治方案》[4]、2006年《肝衰竭诊疗指南》[5]及2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。肝硬化Child-Turcotte-Pugh（CTP）分级B～C级，HBV-DNA 水平每3个月检测1次，且持续6个月以上HBV-DNA PCR<1.0×103 IU/mL；所有患者均经影像学排除肝脏肿瘤，检测前1个月内未使用过血浆、白蛋白等血制品。经宁波市第二医院伦理委员会批准，所有入组病例按1∶1随机法分为两组，一组为干细胞移植组，共30例，其中男22例，女8例，在核苷类似物抗乙肝病毒、护肝、退黄、利尿等常规内科治疗的基础上行APBSC移植；一组为对照组，共30例，其中男20例，女10例，同样予常规内科治疗。移植组年龄（48.93±7.91）岁，对照组年龄（49.57±10.05）岁。腹水例数：移植组：0周：22例；对照组0周：23例。移植前Child-Turcotte-Pugh评分（CTP评分）比较无统计学差异（P>0.05），见表1。

1.2 排除标准

（1）肝硬化终末期合并严重并发症者；（2）生命体征不稳定者；（3）合并其他部位严重感染者；（4）心、肺、肾脏器功能衰竭者。

1.3 方法

1.3.1 吲哚氰绿滞留率检测方法 移植组和对照组均检测ICG R15，所有患者空腹，予0.5 mg/kg 吲哚氰绿（indocyanine green，ICG）静推，10 s内推注完毕，DDG分析仪鼻感光探头连接于患者鼻翼部，利用脉冲式色素浓度图像分析仪检测ICG15 min滞留率（ICG R15）。

1.3.2 干细胞移植方法 移植组在移植前予患者G-CSF（5～10）μg/kg，皮下注射，qd×4 d，若无肥胖或严重消瘦，一般为400 μg/d，稱之为骨髓动员。骨髓动员结束后第2天采集干细胞：从左侧正中经脉引出静脉血，经血细胞分离机，分离出的干细胞，经流式细胞仪检测CD34+细胞数，干细胞数量（2～4）×107个。分离好的干细胞在2 h内经股动脉插管至肝固有动脉经过注射器注入肝固有动脉。移植后的特殊处理：术后常规应用促肝细胞生长素2周，对照组同样适用。

1.3.3 移植组和对照组同样接受综合内科治疗 包括抗病毒治疗（HBV-DNA阴转>6个月）、复方甘草酸苷护肝、腺苷蛋氨酸退黄等治疗。

1.4 观察指标

移植组和对照组均随访至少48周，观察干细胞移植后的副反应、腹水改善情况、1年肿瘤发生率，移植前（0周）、12周、24周、36周、48周ALT、AST、TBil、Alb、PTA、ICG R15等指标变化情况。

1.5 仪器与试剂

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）购自日本麒麟公司，血细胞分离仪购自德国Fresenius Kabi AG生产的COM.TEC血细胞分离仪；ICG试剂（50 mg/瓶，购自辽宁沈阳济世制药有限公司），日本光电 DDG-3300K分析仪及配套分析系统软件为日本光电工业株式会社研发。采用美国Beckman全自动生化仪以及配套试剂。

1.6 统计学处理

采用EPI DATA软件进行资料录入和核对，使用SPSS 13.0统计学软件包进行处理，计量资料用（x±s）表示，行t检验及方差分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APBSC治疗前后TBil、ALT、AST变化情况

移植组移植前后TBil、ALT、AST与同期对照组比较均无统计学差异（P>0.05），见表2；除2例患者移植后2 d出现体温自限性升高外，无其他不良反应。移植前两组TBil、ALT、AST、Alb、PTA、ICG R15比较无统计学差异（P>0.05），见表2～5中0周数据。

2.2 APBSC治疗前后腹水、Alb、PTA、ICG R15变化情况

移植组移植后48周腹水7例，对照组48周腹水15例，两组比较有统计学差异（P<0.05）；移植组Alb、PTA、ICGR15在24周、36周、48周时出现改善，与0周、12周比较有统计学差异（P<0.01），与对照组比较也有统计学差异（P<0.01）。见表3～5；移植组ICG R15随着时间推移其值逐渐降低，移植后36周与48周分别为（38.15±5.48）%、（37.52±6.04）%，与0周比较差异有统计学意义（P<0.05），与12周比较也有统计学差异（P<0.01）；移植后所有病例经B超检查，未发现肝肿瘤发生。

3 讨论

近年来，干细胞移植治疗各种疾病进展非常快，因其来源方便，没有排异反应[7]，在治疗肝病的领域也取得一定进展[8]；目前干细胞移植应用于肝硬化的研究较多，大多数报道为移植后患者肝脏生化改善的研究，关于ICG滞留率即肝脏储备功能等改善的研究尚少。

世界各国有多个学者研究干细胞移植治疗终末期肝病，方法多种多样，主要包括：BM-MSCs及造血干细胞（包括骨髓造血干细胞、脐带血干细胞）等。在干细胞移植治疗上多以肝硬化失代偿期、肝衰竭患者为试验对象，大多数研究集中在移植后肝硬化患者生化指标（总胆红素、白蛋白）、凝血功能的改善，很少有研究涉及肝纤维化、肝硬化程度（肝脏病理改善或无创性纤维化指标改善）的改善及肝脏储备功能改善的研究。干细胞具有向受损肝脏归巢的能力及免疫调节能力[9，10]，这些特性使干细胞移植成为临床治疗肝硬化的重要手段。干细胞移植后有两方面分化潜能：其一，可以改善肝脏的合成能力，增加血清白蛋白合成水平；其二，基质金属蛋白酶的表达明显升高，细胞外基质的降解作用加强，上调凋亡因子，旁分泌抑制星状细胞，并诱导肝星状细胞的凋亡[11]，肝脏内Ⅰ型胶原基因的表达出现明显减少，血清中羟基脯氨酸水平呈现减低趋势，在门静脉及纤维分隔部位可见大量的移植干细胞，移植后肝组织中纤维沉积减少减轻肝纤维化和改善肝功能[3，12-13]。Theise ND[14]、Oh SH等[15]通过实验证实干细胞能向受损肝脏归巢。肝脏储备功能是指在肝脏内具有正常功能的肝实质细胞的总和，其从微观角度可以反映肝脏有效细胞群数量和肝脏血流量，随着肝硬化的进展，肝脏储备功能逐渐下降，并发症增加[16]。在某些领域特别是在外科肝切除等有重要的意义[17]，研究显示ICG清除试验可用来评估肝切除术后、肝移植以及危重症患者是否发生肝功能失代偿的敏感指标，而且简单易行，能很好的反应肝脏储备功能[18]，ICG R15也被认为与门静脉压力以及肝脏纤维化程度成正相关，所以ICG R15在肝脏储备功能的评估中起到重要作用[19]，ICG R15的升高与肝切除术后肝功能衰竭的发生独立相关[20]，有研究认为ICG R15比CTP评分更精确的评估肝脏储备功能[21]，故ICG R15的好坏直接关系到患者的预后，对预测患者的生存期、肝移植与否、外科手术前评估肝脏功能提供重要的依据。

正常人注射ICG 15 min后，血内ICG R15为0%～10%。慢性肝炎ICG R15多在15%～20%，肝硬化时ICG R15为35%左右，ICG R15值越高，肝脏储备功能越差。

本研究结果显示：Alb在移植后12周均值升高约1.5 g/L，24周改善明显与对照组比较有差异，与国内外干细胞移植治疗肝硬化的结果相似；PTA也在移植24周后出现明显改善，均提示肝脏合成功能改善；ICG R15在干细胞移植后24周无明显变化，至移植后36周时出现差异，证实了肝脏储备功能的改善，说明自体外周血干细胞可以改善Alb及肝脏储备功能，但ICG R15改善时间较晚，考虑肝硬化基础存在，细胞外基质降解需要较长时间，肝脏纤维化改善较慢，门静脉血流改善相对较晚，同时也说明并储备功能的改善并不单纯是由干细胞直接作用引起的，可能还与移植后各种免疫调控密切相关。

经过移植后患者ICG R15改善，我们认为与以下密切相关：干细胞转化为肝细胞，干细胞与受损肝细胞的融合，干细胞通过旁分泌机制促进内源性肝细胞的再生，干细胞免疫调节、抗纤维化等[15，22]，但目前干细胞移植后是以何种机制为主改善ICG R15仍需要进一步研究。

综上所述，本研究通过48周的观察结果显示干细胞移植可以改善肝脏功能，但干细胞移植改善肝脏功能能维持多长时间，需要更长的时间来观察。

[参考文献]

[1] Gilchrist ES，Plevris JN. Bone marrow-derived stem cells in liver repair： 10 years down the line[J]. Liver Transpl，2010，16（2）：118-129.

[2] Lanman Xu，Yuewen Gong，Benfu Wang，et al. Randomized trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for hepatitis B virus cirrhosis：Regulation of Treg/Th17 cells[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology，2014，29（8）：1620-1628.

[3] Chiung-Kuei Huang，Soo Ok Lee，Kuo-Pao Lai，et al. Targeting androgen receptor in bone marrow mesenchymal stem cells leads to better transplantation therapy efficacy in liver cirrhosis[J]. Hepatology，2013， 57（4）：1550-1563.

[4] 中華医学会肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案[J]. 中华内科杂志，2001，40（1）：62-68.

[5] 中华医学会肝病学分会. 肝衰竭诊疗指南[J]. 中华临床感染病杂志，2008，1（1）：47-53.

[6] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病分会. 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中华临床感染病杂志，2011，4（1）：1-13.

[7] Cook D，Genever P. Regulation of mesenchymal stem cell differentiation[J]. Adv Exp Med Biol，2013，786（12）：213-229.

[8] Mehdi Mohamadnejad，Kamran Alimoghaddam，Mohammad Bagheri，et al. Randomized placebo-controlled trial of mesenchymal stem cell transplantation in decompensated cirrhosis[J]. Liver International，2013，33（10）：1490-1496.

[9] 游佳，焦艳，郑琦，等. 骨髓问充质干细胞移植干预大鼠肝纤维化/肝癌模型中转化生长因子β1的作用[J]. 中华实验外科杂志，2014，10（31）：2112-2114.

[10] 郑林华，楚金东，谭灵，等. 自体外周血干细胞移植对乙肝相关终末期肝病患者免疫功能的调节作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2013，29（4）：407-410.

[11] Yu J，Su X，Zhu C，et al. GFP Labeling and Hepatic Differentiation Potential of Human Placenta-Derived Mesenchymal Stem Cells[J]. Cell Physiol Biochem，2015，35（6）：2299-2308.

[12] Mona A Amin，Dina Sabry，Laila A Rashed，et al. Short-term evaluation of autologous transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in patients with cirrhosis：Egyptian study[J]. Clinical Transplantation，2013， 27（4）：607-612.

[13] Ki Tae Suk，Jung-Hwan Yoon，Moon Young Kim，et al. Transplantation with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells for alcoholic cirrhosis：Phase 2 trial[J]. Hepatology，2016，64（6）： 2185-2197.

[14] Theise ND，Badve S，Saxena R，et al. Derivation of hepatocytesfrom bone marrow cells in mice after radiation[J]. Induced myeloablation. Hepatology，2000，31（1）：235-240.

[15] Oh SH，Witek RP，Bae SH，et al. Bone marrow-derived hepatic ovalceils differentiate into hepatocytes in 2-acetylaminofluorene/partial hepatectomy induced fiver regeneration[J]. Gastroenterology，2007，132（3）：1077-1087.

[16] Schneider PD. Preoperative assessment of liver function[J].Surg Clin North Am，2004，84（2）：355-373.

[17] Liang Peng，Dong-ying Xie，Bing-Liang Lin，et al. Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liver failure patients caused by hepatitis B：Short-term and long-term outcomes[J]. Hepatology，2011， 54（3）：820-828.

[18] Faybik P，Hetz H. Plasma disappearance rate of indocyanine green in liver dysfunction[J]. Transplant Proc，2006， 38（3）：801-802.

[19] Yang YL，Di L，Duan YY，et al. A prospective experimental study of liver fibrosis with ultrasound and its correlation with hepatic reserve function and hemodynamics[J]. BMC Gastroenterol，2012，12（1）：168.

[20] Greco E，Nanji S，Bromberg IL，et al. Dictors of peri-opertative morbidity and liver dysfunction after hepatic resection in patients with chronic liver disease[J]. HPB（Oxford），2011，13（8）：559-565.

[21] Xu Y，Ren Z，Zhu S，et al. Surgical risks for patients with hepatolithiasis undergoing hepatectomy[J]. Zhong Nan Da Xue Bao Yi Xue Ban，2012， 37（9）：916-919.

[22] Takeda M，Yamamoto M，Isoda K，et al. Availability of bone marrow stromal cells in three-dimensional coculture with hepatocytes and transplantation into liver-damaged mice[J]. J Biosci Bioeng，2005，100（1）：77-81.

（收稿日期：2016-06-04）