RGS20基因在Luminal型乳腺癌的表达及临床病理特征相关性研究

李权　孙艺涵　蔡业丰

[摘要] 目的 探讨RGS20基因表达与Luminal型乳腺癌临床病理特征的关系。 方法 利用癌症基因组图谱数据库（TCGA数据库）筛选出1023例乳腺癌病例和98例癌旁对照样本，收集RGS20基因表达谱资料和临床信息资料，分析RGS20基因表达与乳腺癌临床病理特征的相关性及对预后的影响。结果 RGS20基因在不同乳腺癌分子分型中存在明显的表达差异，其中在Luminal型乳腺癌为低表达，而在三阴性乳腺癌中为高表达。同时在Luminal型乳腺癌中，对RGS20基因表达水平与其临床病理特征进行分析，发现RGS20基因表达水平与人种存在相关性（P<0.05），其在黑种人中表达最高。进一步分析发现RGS20表达水平与ER受体水平存在密切相关（P<0.001），ER受体阳性组其RGS20为低表达。 结论 RGS20基因在Luminal型乳腺癌中表现为低表达，有别于其他类型的乳腺癌，且其表达水平与人种存在相关性，其中可能的机制是ER受体表达导致了RGS20基因的低表达，RGS20基因可能成为Luminal型乳腺癌的一个新的分子标志物。

[关键词] RGS20；乳腺癌；Luminal型乳腺癌；临床病理特征

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0021-05

[Abstract] Objective To study the relationship between RGS20 gene expression and clinicopathological features of Luminal breast cancer， since the relationship between RGS20 and clinicopathological features of Luminal type breast cancer is not studied so far. Methods RGS20 gene expression and clinical information were collected by screening 1023 cases of breast cancer patients and 98 cases of paracancerous tissue samples in TCGA database. The correlation between RGS20 gene expression and clinicopathological features and prognosis of breast cancer was analyzed. Results The expression levels of RGS20 gene were significantly different in different molecular types of breast cancer， which was low in Luminal type breast cancer and high in triple negative breast cancer. the expression level of RGS20 gene and its clinicopathological features were analyzed in Luminal type breast cancer. The expression level of RGS20 gene was found statistically correlated with human race（P<0.05）， which was the highest among black people. Further analysis showed that RGS20 expression was closely related to ER receptor levels（P<0.001）， and ERGS-positive group had low RGS20 expression. Conclusion RGS20 gene is expressed in Luminal type breast cancer， which is different from other types of breast cancer， and its expression level is related to human race. The possible mechanism is that ER receptor expression leads to low expression of RGS20 gene. Therefore， RGS20 gene may become a new molecular marker of Luminal type breast cancer.

[Key words] RGS20； Breast cancer； Luminal type breast cancer； Clinicopathological features

乳腺癌是一種复杂异质性疾病，在组织学形态、细胞起源、突变、转移、疾病分级、治疗反应性及临床表现等方面均有不同[1]。基于乳腺癌达分子表型，乳腺癌一般被分为3种亚型：Luminal型，Her-2多表达型，三阴性型乳腺癌。Luminal型乳腺癌是指雌激素受体阳性乳腺癌，约占所有乳腺癌的2/3。Lumina乳腺癌往往形态学上分化较好，与其它类型相比预后较好。

G蛋白信号调节蛋白（RGS蛋白）是一种Gα亚基GTP酶活性增敏剂，能使GTP酶活性增加100倍，突然中断G蛋白信号，并对G蛋白耦联受体（GPCRs）的生物学特征产生显著的影响。G蛋白偶联受体（GPCRS）家族是一种细胞表面受体，多项证据证明改变GPCRS的表达水平和活性能够调节多种细胞功能比如细胞增殖、存活能力、运动性和肿瘤的生长、血管生成和转移。RGS蛋白和GPCRS的结合具有高度选择性，产生完全不同的分子作用。RGS蛋白在卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中都有不同程度的表达，并作为一种致癌信号在肿瘤的发生和发展中起到重要作用，至少有6种RGS蛋白（RGS2、4、10、16、17、19）参加细胞增殖调节[2-5]。RGS20同属于RZ/A家族，氨基末端区富含一串与膜附着有关的半胱氨酸基序，在大脑中高表达，尤其是尾状核和颞叶。RGS20通常被认为是Gαz选择性GTP酶激活蛋白，同时也可以与Gαi亚基相互作用从而削弱细胞信号传递。RGS20自身并没有致癌潜能，但是在小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）它通过增加致癌性的Rasgv引导肿瘤病灶形成，调节细胞聚集，运动性和侵袭能力促进细胞转移。同时，RGS20在转移黑色素瘤和转移乳腺癌中高表达[6-8]。

目前，国内外鲜有RGS20基因和乳腺癌的相关性研究，本研究旨在通过检测RGS20基因在各类型乳腺癌组织中的表达，并探讨RGS20与luminal型乳腺癌的临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 TCGA数据库分析

癌症基因组图谱（TCGA）数据库是目前最大的癌症生物信息数据库，包含了大量的生物医学信息，我们从中选取乳腺癌患者的RGS20基因表达数据和临床数据，在TCGA数据库中筛选得到1023例乳腺癌病例和98例癌旁对照样本用于分析研究。

按照2011年《St. Gallen》的乳腺癌分子分型指南，对乳腺癌进行分子分型：Luminal 型（ER和/或 PR+）、Her-2阳性型（Her-2过表达、ER 和 PR-）、三阴性型（ER 和 PR-、Her-2-）。根据上述乳腺癌分子分型标准，在TCGA数据中，筛选出Luminal型乳腺癌共有824例，Her-2阳性型乳腺癌共有38例，三阴性型乳腺癌共有161例。同时，收集入组患者的临床数据：性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等数据，以及收集RGS20的转录组数据（RPKM），以RGS20基因转录组表达数据的中位数作为区分RGS20高低表达的界值，进行后续统计学分析。

1.2 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件包（IBM SPSS statistics 21.0）进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢验来判断其是否符合正态分布，如果符合正态分布，则组间比较采用独立样本t；若不符合正态分布，则采用非参数Mann-Whitney检验。计数资料以频数及率[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验及Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 RGS20基因在不同亚型乳腺癌中表达情况

在TCGA数据库中，根据乳腺癌分子分型标准，将乳腺癌患者分为Luminal型乳腺癌（ER+/PR+）824例，Her-2阳性型乳腺癌（ER-/PR-，Her-2+）38例和三阴性型乳腺癌（ER-/PR-，Her-2-）161例，分别计算各组的RGS20基因的表达水平。在所有分组中，RGS20基因的表达水平在所有乳腺癌中的表达明显低于正常组（1023 vs. 98，P=0.002）。RGS20基因在三阴性型乳腺癌中的表达明显高于正常组织（161 vs. 98，P<0.001），RGS20基因在Luminal型乳腺癌中的表达明显地低于正常组织（824 vs. 98，P<0.001），然而RGS20基因在Her-2阳性型乳腺癌中的表达与正常组并没有显著的统计学差异（38 vs. 98，P=0.512），见图1。

2.2 RGS20基因与Luminal型乳腺癌的临床病理特征关联性分析

本研究进一步探索RGS20基因与luminal型乳腺癌的临床病理特征之间的相关性，见表1。结果发现：RGS20基因表达高低与年龄、TNM临床分期、病理分期、淋巴结转移等临床病例特征之间不存在统计学相关性，但是意外发现在Luminal型乳腺癌中，RGS20基因的表达与人种存在相关性，差异有统计学意义（P=0.009），在黑种人中表达最高，黄种人次之，白中人最低，见图2。

2.3 RGS20基因表达与ER受体状态的相关性

由于RGS20基因表达水平在Luminal乳腺癌组织、正常乳腺组织、三阴性乳腺癌组织中递增，由此我们推测RGS20基因表达与ER受体表达程度有关。为了验证此假设，我们将TCGA数据库分成ER阳性组和ER阴性组，分别比较两组RGS20基因的表达水平，发现ER阴性组的乳腺RGS20基因表达水平显著高于ER阳性组，差异有统计学意义（808 vs. 215，P<0.001），见图3。

3讨论

2015年中国癌症年度报道公布了最新的国家癌症统计数据，乳腺癌发病高居女性恶性肿瘤之首。仅乳腺癌新发人数就占据新发女性恶性肿瘤总数的15%，预计2015新发乳腺癌达272400人，因乳腺癌死亡人数达70700人。资料显示乳腺癌是女性30～59岁年龄组最常见的癌症，同时乳腺癌是45岁以下女性因癌致死最常见的原因。女性乳腺癌的年龄标准发生率和死亡率均呈现上升趋势，具体升高程度不详[9]。其中乳腺癌最常见的类型为luminal型乳腺癌，Luminal型又分为Luminal A型（ER+，PR+，Her-2-，ki-67低表达）和Luminal B型（ER+，PR+，Her-2+或ki-67高表达），虽然同属激素受体阳性，但是临床特点及对治疗反应性和预后有明显差异[10]。Luminal A是乳腺癌最常见的分子亚型，通常为早期乳腺癌，复发风险较低，对内分泌治疗敏感，化疗不敏感，预后最好[11]。与Luminal A相比Luminal B的诊断时年龄更轻，肿块更大，进展相对较快，腋窝淋巴结转移率更高，激素受体水平较低，肿瘤组织学分级更高，对内分泌治疗敏感性较低，化疗较敏感，预后相对较差[12]。相关研究表明Luminal A和Luminal B在五年生存率上并没有统计学差异，但是Luminal B型乳腺癌在确诊后5年内复发率较高[13]。

到目前为止已经发现了至少20种RGS蛋白，每种均有含有大约120个氨基酸的保守序列，正是这保守区使得RGS蛋白能够负性调节G蛋白信号[14，15]。RGS蛋白家族参与多种细胞功能的调节，包括促进肿瘤发生和进展，增值，分化，对神经递质反应，跨膜转运，胚胎发育等[16]。最近多项的研究表明RGS蛋白不仅仅是Gα亚基GTP酶激活蛋白，在不同细胞中还表现出不同的分子功能。随着对RGS蛋白家族研究的深入，许多RGS蛋白被证明与肿瘤进展相关。比如，RGS17在肺癌和膀胱癌中通过促进cAMP信号通路和CREB磷酸化维持肿瘤细胞的增殖。RGS19通过与GAIP（Gα-interacting protein）作用蛋白的羧基端的PDZ基序结构耦联促进细胞增殖。RGS16具有促进甲基化的作用，可以影响乳腺癌的蛋白表达。RGS4通过阻断MMP2/9减少细胞浸润和转移。已经有一些RGS蛋白被验证具有调节细胞迁移的能力，比如RGS1与调节趋化因子诱导的淋巴细胞转移有关，RGS3影响鼠类动物B淋巴细胞转移[4，5，17-19]。此外，针对RGS蛋白的靶向治疗药物的研究也不断出现[19]。

在此项研究中，通过分析TCGA数据库我们发现Luminal型乳腺癌RGS20基因表达低于正常对照组，RGS20基因在三阴性乳腺癌型中呈现高表达，然而Her-2阳性乳腺癌与正常组之间无统计学差异。三阴性乳腺是一种侵袭性极高，恶性程度高，复发率高的高危型乳腺癌。三阴性乳腺癌占浸润性乳腺癌的10%～20%[20]，非裔美国人和非洲女性发病率较高，可高达50%。亚洲女性发病率与白人女性发病率相似，BRCA1突变患者中更多[21]。好发于相对年轻的妇女，预后通常较差[22]。而Luminal型是乳腺癌最常见的分子亚型，预后想对较好，局部复发和远处转移的机率较低[10]。综合结果表明RGS20基因在乳腺癌中的高表达可能具有促癌作用，提示是RGS20基因可能是一种致癌基因，提示预后不佳。已有两项研究发现RGS20在黑色素瘤和转移性乳腺癌中转录水平显著提升，暗示RGS20具有促癌作用[8，23]。由此推断luminal乳腺癌预后较好可能与RGS20低表达有关。另一个有意思的现象，RGS20基因在三阴性型乳性癌和luminal型乳腺癌中呈相反的表达，可能归因于在雌激素敏感基因中通过褪黑色抑制RGS20基因表达或者促进RGS20基因降解[24-26]，根据TCGA数据库的分析，ER受体水平与RGS20基因表达成负相关，从而解释了RGS20基因在Luminal型乳腺癌表达比正常乳腺组织低，而三阴性乳腺癌的RGS20基因表达高于正常乳腺组织。此外我们发现，在Luminal型乳腺癌中不同人种表达存在显著差异，黑种人RGS2基因高表达。国外有文献报道在ER阳性乳腺癌人群中，黑人相较于白种人有较差的预后，并且此差距在明确诊断后两年内最明显[26，27]。这与本研究结果一致，间接表明RGS20基因高表达在乳腺癌中的促癌作用。综上所述，此项研究为说明在乳腺癌中RGS20基因可能是一个致癌基因，其在Luminal型乳腺癌中RGS20基因低表达，而三阴性乳腺癌高表达，可能与ER受体的表达有关，同时也说明其对乳腺癌的预后有一定的影响，提示RGS20基因可能作为一种新分子标志物判断乳腺癌的进展和预后。

目前，RGS20基因作为作为一种致癌基因，促进细胞侵袭和浸润的机制尚未明确被阐述。早前一项研究提示RGS20基因可能通过多种不同途径，在转录或翻译水平调控肿瘤转移浸润。一方面RGS20基因促进上皮-间充质转变从而進一步促进细胞间连接的分解，下调钙粘连蛋白上调波形蛋白增加细胞运动性和侵袭性。一方面和RGS17基因相似的是，RGS20基因很有可能间接地通过活化cAMP/PKA通路调节细胞聚集和转移。另一方面，RGS20 基因参加一些Gi/z偶联受体如褪黑素，MT1， 阿片μ受体，toll样受体等的信号转导影响细胞浸润转移[26]。

本研究结果提示在Luminal型乳腺癌中低表达，而RGS20基因在三阴性乳腺癌中高表达，由此推测Luminal型乳腺癌的良好预后可能与RGS20基因低表达密切相关。此外RGS20基因高表达与ER受体低表达，在luminal型乳腺癌中，其表达与人种存在相关性，说明RGS20基因可能是Luminal型乳腺癌的一个新分子标志物。

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（收稿日期：2016-06-12）