参松养心胶囊和稳心颗粒对大鼠心肌纤维化的影响及其抗心律失常的机制研究

吴艳婷，陈 云，刘海亭，吴莹莹，吴 伟，刘新灿

·基础医学论著/研究·

参松养心胶囊和稳心颗粒对大鼠心肌纤维化的影响及其抗心律失常的机制研究

吴艳婷，陈 云，刘海亭，吴莹莹，吴 伟，刘新灿

目的 探讨参松养心胶囊和稳心颗粒对大鼠心肌纤维化的影响及其抗心律失常的机制。方法 选取自发性高血压大鼠(SHR)40只随机分为4组，每组10只，对照组(C组，正常饲料喂养)，缬沙坦组(VAL组，缬沙坦胶囊内容物混合饲料喂养)，参松养心胶囊组(SHEN组，参松养心胶囊内容物混合饲料喂养)，稳心颗粒组(WEN组，稳心颗粒混合饲料喂养)。喂养2个月后，进行心室内快速刺激，记录心律失常发生。之后处死大鼠，进行左心室组织切片，染色处理，观察各组切片纤维化程度，并采用免疫组化测定心肌细胞缝隙连接蛋白(Cx43)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达程度，进行比较。结果 喂养2个月后，VAL组、SHEN组及WEN组心律失常诱发次数均较C组明显减少(P<0.05)；图像定量分析显示VAL组、SHEN组及WEN组Cx43增高，MMP-2和组织金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)和荧光信号的面积百分比及积分光密度值较C组明显降低(P<0.05)，且排列相对清晰。结论 参松养心胶囊及稳心颗粒具有改善心肌重构的作用，能延缓心肌纤维化发展，降低致命性心律失常的发生率；其机制可能与增加Cx43及MMP-2的表达有关。

室性心律失常；参松养心胶囊；稳心颗粒；心肌纤维化；缝隙连接蛋白；基质金属蛋白酶-2；组织金属蛋白酶抑制因子-2

心律失常是临床上一种常见病、多发病，随着对心律失常认识的加深，发现其发病机制主要是心肌电活动紊乱，并与心肌纤维化程度呈正相关[1]。心肌纤维化增加和心肌组织电兴奋的离散度，导致心律失常发生。

随着心肌纤维化程度的增加，伴随缝隙连接蛋白(connexin43，Cx43)表达减弱[2]、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表达增多和组织金属蛋白酶抑制因子-2(tissue inhibitor matrix metauoproteinase-2，TIMP-2)表达减少，心律失常发病率明显增高，并增加病人猝死风险[3]。

目前，临床上常用的抗心律失常药物主要有钠通道阻滞剂、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂，这些药物通过阻断相关离子通道以减少心律失常发生，但这些药物有严重致心律失常作用。有研究发现，血管紧张素抑制剂[4]、血管紧张素受体拮抗剂[5]类抗高血压药，可延缓高血压病人心肌重构，改善病人心衰症状，病人相应的致命性心律失常发病率明显下降，预后明显改善。解剖上，中层心肌与心外膜下心肌及心内膜下心肌之间交界面处存在心肌结构差异性，使三层心肌之间的单相动作电位复极速度和传导速度均有差别，这为左心室心肌壁内心电折返形成提供重要的解剖基础[6]。研究表明，改善心肌重构作用药物可适当延缓心肌纤维化的发展，从而降低致命性心律失常的发生率[7-8]。

中药治疗疾病具有多环节，多靶点作用机制的特点，本研究通过观察中药参松养心颗粒[9]和稳心颗粒[10]对心肌纤维化的影响，以探讨中药抗心律失常的作用机制。为中医药治疗心律失常的研究开辟新的研究途径，进一步发展中医药事业。

1 材料与方法

1.1 实验动物 自发性高血压(SHR)大鼠40只，雌雄各半，体重250 g～370 g，SPF级，适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药品、试剂和仪器 缬沙坦胶囊为北京诺华制药有限公司生产，参松养心胶囊为石家庄以岭药业股份有限公司生产，稳心颗粒为山东步长制药有限公司生产；抗Cx43单克隆抗体，产品编号为MAB3067，Millipore公司生产；抗MMP-2抗体购自晶美公司，产品编号为JMA0816；抗TIMP-2抗体购自晶美公司，产品编号为JXC5273。ViVi7型彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司)、Power Lab30血流动力学数据采集分析系统(AD instruments)、无创尾动脉血压测定仪(Visitech Systems，BP-2000)，激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，FV1000-IX81)、荧光显微镜(Olympus，BX41)。

1.3 方法 将40只SHR大鼠随机分为对照组(正常饲料喂养，C组)、缬沙坦组(缬沙坦胶囊内容物混合饲料喂养，VAL组)、参松养心胶囊组(参松养心胶囊内容物混合饲料喂养，SHEN组)、稳心颗粒组(稳心颗粒混合饲料喂养，WEN组)，每组10只。适应性给予正常饮食1周后，开始2个月不同饲料喂养。

1.4 指标测定

1.4.1 心律失常诱发次数 将大鼠进行腹腔麻醉后固定、行气管插管。连接肢体导联心电图后，描记正常状态下的心电活动情况，之后经左前胸第3肋、4肋间开

胸并暴露心脏，以双极针刺入左室心尖部作为刺激电极，进行程序电刺激以诱发室性心律失常并记录心电活动情况，电生理参数采用BL-420生物信号采集与处理系统记录。程序电刺激S1S1周长为100 ms，波宽2 ms，电压5 mV，脉冲数为8个；S2强度为5 mV，波宽为2 ms，脉冲数为1个，步长为-2 ms，直至S2后不再出现R2，即不应期或诱发出室性心律失常。若未能诱发室性心律失常，将S1S2间期设为不应期加10 ms，并加用期前刺激S3，以2 ms递减刺激直到不应期或诱发出室性心律失常。此处室性心律失常特指连续出现6个及6个以上宽QRS波的室性心动过速(室速)或心室颤动(室颤)。

1.4.2 心脏重量指数 所有大鼠于心脏电刺激诱发室性心律失常后取出心脏，以冰生理盐水反复冲洗，再用滤纸吸干水分，电子天平称全心重量和左心室重量，心脏重量与体重比值即为心脏重量指数；左心室重量与体重比值即为左心室重量指数。

1.4.3 胶原容积分数 取近心尖部左心室组织，中性甲醛常规固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋和切片，进行Masson染色，采用图像分析软件随机选取5个视野，测定心肌间质胶原容积分数(胶原面积/心肌总面积)，取其均值。1.4.4 免疫组化法分析检测Cx43，MMP-2及TIMP-2 将心肌组织固定，脱水，石蜡包埋，制成5 μm切片，每个心肌蜡块制备5张切片。随后按照说明书步骤进行操作，其中分别以抗Cx43单克隆抗体，抗MMP-2抗体及抗TIMP-2抗体以1∶100稀释，显微镜下滴加DAB显色，阴性对照用PBS代替一抗。每张切片取4个视野，逐层扫描获取图像，将获取的厚图像去除背景，留下真正荧光染色部分以供分析。采用Image Pro Plus 6.0软件分析荧光强度，计算当前视野下Cx43、MMP-2及TIMP-2面积百分比及积分光密度。

2 结 果

2.1 各组大鼠心律失常诱发次数比较 VAL组、SHEN组及WEN组心律失常诱发次数均较C组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；SHEN组即WEN组心律失常诱发次数与VAL组比较，差异无统

计学意义(P>0.05)。详见图1、表1。

注：A为室速；B为室颤。图1 程序电刺激诱发的室性心律失常表1 各组大鼠心律失常诱发次数比较

2.2 各组大鼠心脏重量指数和左心室重量指数比较 VAL组、SHEN组及WEN组心脏重量指数、左心室重量指数均小于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；与VAL组比较，SHEN组及WEN组心脏重量指数、左心室重量指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心脏重量指数和 左心室重量指数比较(±s) mg/g

2.3 各组大鼠心肌细胞Cx43(面积)比较 正常心肌细胞的Cx43线性规律分布于心肌细胞闰盘处，免疫组化染色阳性呈棕黄色。大鼠心肌细胞中Cx43含量，VAL组、SHEN组、WEN组与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SHEN组、WEN组与VAL组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

2.4 大鼠心肌细胞MMP-2含量(面积)比较 VAL组、SHEN组、WEN组与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SHEN组、WEN组与VAL组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

2.5 大鼠心肌细胞TIMP-2含量(面积)比较 VAL组、SHEN组与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；WEN组、SHEN组与VAL组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠Cx43、MMP-2、 TIMP-2含量(面积)比较(±s) %

3 讨 论

高血压病引起的心室重塑是慢性心力衰竭的重要环节，而心肌纤维化和Cx43、MMP-2及TIMP-2表达改变是心室重塑的重要表现形式。心肌纤维化可导致心脏舒张、收缩功能障碍，还可导致心律失常发生[11-13]。Cx43表达量减少、非均匀化及侧面化认为是Cx43重构的表现形式。Cx43表达量减少和非均匀化可改变电传导同向性，使电传导速率降低，且易形成折返，导致心律失常；而其侧面化，可引起延迟后去极化[14-15]。而MMP-2是胶原降解成小分子多肽的关键酶，在生理状态下与其特异性抑制剂TIMP-2处于相对平衡状态，使细胞外基质降解与合成达到动态平衡。心肌纤维化发生时可见MMP-2表达增多和TIMP-2表达减少。病理条件下心肌CX43、MMP-2及TIMP-2重塑构成心律失常的部分基础。

参松养心胶囊及稳心颗粒是祖国医学的产物，是心律失常治疗的重要补充手段，但其作用机制尚不明确。参松养心胶囊是依据络病学理论，由人参、麦冬、山茱萸、丹参、酸枣仁、桑寄生、赤芍、土鳖虫、甘松、黄连、五味子、龙骨研制而成的一种复方制剂。既往研究表明，参松养心胶囊具有减轻糖尿病大鼠心室电重构和结构重构并抑制室性心律失常的作用[16]。本研究结果发现，以参松养心胶囊喂养SHR大鼠可增强Cx43表达，改善心肌纤维化从而减少室性心律失常发生。稳心颗粒是由党参、黄精、三七、甘松、琥珀等制成，具有益气养阴、定悸复脉、活血化瘀的功效，具有很好抗心律失常作用[17]。郭继鸿等[18-20]研究证实稳心颗粒中的缬草酮具有膜稳定作用，能延长动作电位时程，抑制折返形成与维持。美国Main Line Health Heart中心严干新教授进行稳心颗粒阻断多种离子通道作用，再次证实稳心颗粒具有多种离子通道的阻断作用。而现代医学表明，小檗碱、苦参碱等一些中药成分可明显改善心脏离子通道功能紊乱，具有明显的多个离子通道靶点作用特点[21]。通过本研究验证稳心

颗粒可通过抑制MMP-2表达和增强TIMP-2表达而改善心肌纤维化，从而减少室性心律失常发生。

张卫泽等[22]研究已证明缬沙坦有诱导大鼠心肌Cx43表达，减少MMP-2表达和增强TIMP-2表达。本研究通过与缬沙坦组用药比较，表明参松养心胶囊及稳心颗粒均通过诱导Cx43表达，减少XMMP-2表达和增强TIMP-2表达而减轻心肌纤维化、延缓心室重塑，从而降低室性心律失常发生率。参松养心胶囊主要通过增强Cx43表达而改善心肌纤维化从而减少室性心律失常的发生；稳心颗粒主要通过抑制MMP-2表达和增强TIMP-2表达而改善心肌纤维化，从而减少室性心律失常发生。进一步阐明二者治疗心律失常的作用机制，并验证中药治疗心肌纤维化所致室性心律失常的多离子通道靶点作用。

本研究存在一定的局限性，由于研究中应用复方制剂作为干预手段，未能明确药物具体作用成分，因此，还需要更多相关研究以进一步证实中药有效成分对改善心肌纤维化从而减少室性心律失常发生的作用机制。

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(本文编辑薛妮)

Effects of Shensong Yangxin Capsule and Wenxin Granule on Myocardial Fibrosis in Rats and Its Antiarrhythmic Mechanism

Wu Yanting， Chen Yun， Liu Haiting， Wu Yingying，Wu Wei， Liu Xincan

The First Affiliated Hospital，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000， Henan，China

Objective To study the effect of Shensong Yangxin capsule (SYC) and Wenxin granule (WXG) on myocardial fibrosis in rats and its antiarrhythmic mechanism.Methods Forty spontaneously hypertensive rats (SHR) were randomly divided into 4 groups: control group (n= 10) fed with normal feed， valsartan group (n= 10) fed with valsartan capsule content mixed feed， SYC group (n= 10) fed with SYC contents mixed feed， WXG group (n= 10) fed with WXG contents mixed feed for 2 months. After 2 months of feeding， rapid ventricular stimulation was performed， and the occurrence of arrhythmia was recorded.After the rats were killed， the left ventricular tissue sections were stained， the degree of fibrosis was observed.The expression of connexin 43 (Cx43)， matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of matrix-metalloproteinase-2 (TIMP-2) in cardiac muscle cells was measured by immunohistochemistry. Results After feeding for 2 months， the occurrence of arrhythmia in valsartan group，SYC group，and WXG group were significantly less than that in control group (P<0.05). Quantitative image analysis showed that the expressions of Cx43 in valsartan group，SYC group，and WXG group were higher than that in control group (P<0.05) ，while the expressions of MMP-2 and TIMP-2 in valsartan group，SYC group，and WXG group were lower than that in control group (P<0.05). Conclusion SYC and WXG has the effects on myocardial remodeling， can delay the development of myocardial fibrosis， thereby reducing the incidence of fatal arrhythmia.The mechanism may be related to the increased expression of Cx43 and MMP-2.

ventricular arrhythmia；Shensong Yangxin capsule；Wenxin granule；myocardial fibrosis；connexin 43；matrix metalloproteinase-2；tissue inhibitor of matrix-metalloproteinase-2

河南中医药大学第一附属医院(郑州 450000)，E-mail：15093362768@163.com

引用信息：吴艳婷，陈云，刘海亭，等.参松养心胶囊和稳心颗粒对大鼠心肌纤维化的影响及其抗心律失常的机制研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(8)：924-927.

R541.7 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.08.007

1672-1349(2017)08-0924-04

2016-08-11)