玉米FLA蛋白家族的生物信息学分析

钟静+胡颖+陈亚波+宋群星

摘要：类成束阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan proteins，简称FLAs）是一类广泛分布于植物体内的富含羟脯氨酸的糖蛋白，在植物生长发育和形态构建中发挥着重要作用。基于已公布的玉米蛋白数据库确定了26个FLA蛋白，并对其理化性质、系统发生树、蛋白结构和功能域等进行了分析。结果表明，FLA蛋白氨基酸长度在249～682个之间，理论等电点在4.99～10.76之间，主要定位在质膜上，多数为疏水性蛋白；二级结构由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链等元件组成；部分蛋白空间结构具有较强保守性。

关键词：玉米；FLA；蛋白家族；基因家族；生物信息学；理化性质；结构特征

中图分类号： Q943.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0023-05

阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan proteins，简称AGPs）是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白[1]。根据核心蛋白骨架差异，AGPs被分为经典AGPs（classical AGPs）、非经典AGPs（non-classical AGPs）、赖氨酸富集AGPs（lysine-rich AGPs）、AG多肽（AG peptides）、类成束蛋白AGPs（fasciclin-like arabinogalactan proteins，简称FLAs）、类木质形成素AGPs（xylogen-like AGPs，简称XLAs）和类植物蓝素AGPs（phytocyanin-like AGPs，简称PLAs）等7类[2-4]。AGPs的蛋白骨架一般包括N端信号肽和1段长度可变且富含脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）的区域（PAST）[1]。经典AGPs还包含1个C端GPI锚定信号。FLAs作为AGPs的1个亚类，除具有AGPs的典型结构之外，还含有1～2个成束蛋白结构域（fasciclin domains，简称FAS）[5]。

FLAs在植物生长发育过程中发挥重要作用。有研究显示，FLAs参与了茎、侧根、花粉小孢子发育，以及棉花纤维细胞的伸长等过程[6-8]，此外还可影响植株茎的强度和弹性[9]。对其作用机制的研究表明，FLAs可能是通过影响细胞壁的形成从而发挥其生物学功能[10-13]。目前已经在拟南芥、油菜、水稻、小麦中分别鉴定出了21、33、27、34个FLAs[3，5，14-15]，但是在重要的粮食和经济作物玉米中还未见关于FLAs的报道。因此，本研究采用生物信息学方法，对玉米FLAs蛋白家族成员进行全面的鉴定和系统进化分析，并进一步分析其蛋白质产物的理化性质、结构特征和功能域等特点，以期为进一步揭示植物FLAs的结构和功能奠定基础。

1材料与方法

1.1序列来源

分别从Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）、Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）数据库中下载玉米中含有FAS结构域的蛋白序列[16-17]。将获得的序列提交到maizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）数据库中进行比对，获得目标蛋白质的全长序列。从拟南芥官方数据库TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）中下载获得拟南芥FLAs基因和蛋白序列数据。

1.2序列分析

利用Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計算相对分子量及理论等电点。利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、Plant- mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）分析蛋白信号肽和亚细胞定位[18]。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析蛋白亲水性/疏水性。利用NPS（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_hnn.html）分析蛋白质的二级结构。利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白质的三级结构。

1.3模体识别

利用MEME program3（http：//meme-suite.org/）模体搜索工具识别FLAs家族相关蛋白质所共有的模体，并对相关参数进行修改，将可找到的模体数最大值调整为15个，每个模体的最大宽度调整为100，其他均为默认值[19]。

1.4系统进化树的构建

应用多序列比对工具ClustalX 1.83对玉米、拟南芥FLAs氨基酸全序列进行比对[20]。采用MEGA7.0软件中的邻接法（neighbor-joining，简称NJ）构建系统发育树[21]。通过随机逐步比较的方法搜索最佳系统进化树，对生成的系统树进行Bootstrap校正。

2结果与分析

2.1玉米FLAs家族成员的鉴定和理化性质分析

分别从Pfam、Interpro数据库下载玉米中含有FAS结构域的蛋白序列，并将获得的序列分别提交到maizeGDB数据库中进行比对，获得其全长序列。对来源于2个数据库中的蛋白质全长进行交叉比对，去除重复序列。进一步将获得的蛋白序列提交到SignalP 4.1检测N端信号肽，不含有信号肽的不属于AGPs家族。对含有信号肽的序列手动查找其中富含PAST的区域，并将蛋白序列提交到PSORT检测C端糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号，最终获得了26个玉米FLAs并分别命名为 ZmFLA1～ZmFLA26（表1）。

对这26个ZmFLAs进行氨基酸理化性质分析表明，氨基酸序列长度在249～682个之间，分子量在25 175.47～72 410.16 u 之间，理论等电点在4.99～10.76之间（表1）。亚细胞定位分析显示，绝大多数ZmFLAs都定位在质膜上，其中 ZmFLA8、ZmFLA14除定位在质膜上外，还可能定位在核中，而ZmFLA5则仅定位在核上（表1）。亲水性/疏水性分析显示，ZmFLA2/6/24 亲水区域明显大于疏水区域，说明这3个 ZmFLA 蛋白亲水性较强，为亲水性蛋白；其余23个 ZmFLA 蛋白为疏水性蛋白（表1）。N-糖基化位点检测结果显示，所有 ZmFLAs 都至少含有1个N-糖基化位点，ZmFLA22 甚至包含7个N-糖基化位点（表1），说明ZmFLAs蛋白骨架可能具有较高的糖基化修饰率。

2.2ZmFLAs系统进化和序列特异性分析

对玉米、拟南芥中的FLAs进行系统进化分析显示，26个ZmFLAs、21个AtFLAs被聚类在8个独立的进化分支中（图1-A）。分支Ⅷ仅含有2个AtFLAs，其余7个分支都同时有ZmFLAs、AtFLAs的分布。但是在同一分支中的ZmFLAs、AtFLAs 并无明显交叉分布，来源于不同物种的FLAs通常分别聚类在小的分支中。例如分支Ⅱ含有2個拟南芥FLAs、5个玉米FLAs，其中AtFLA1、AtFLA2聚类在1个小分支中，而ZmFLA4/10/19聚类在另1个小分支中。进一步的序列特异性分析显示，尽管玉米、拟南芥的FLAs都含有模体1，但是不同的FLAs含有其他不同的模体。同时，处于同一个进化分支中的FLAs往往具有类似的模体。例如进化分支Ⅰ中，AtFLA3/5/14、ZmFLA14都含有模体1、模体7、模体8、模体11，ZmFLA12/16/25则含有模体1、模体8、模体11；模体10仅出现在分支Ⅱ、Ⅲ的蛋白质序列中，而模体4、模体5、模体9仅出现在分支Ⅴ中（图1-B）。

2.3ZmFLAs蛋白结构分析

通过NPS程序对这26个ZmFLAs蛋白序列进行二级结构分析表明，蛋白质均由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成，但是这3种元件的比例和分布存在差异。其中无规则卷曲所占比例最高，在38.05%～58.97%之间；其次为 α-螺旋，在25.93%～46.83%之间；延伸链所占比例最低，在8.86%～21.63%之间（表2）。进一步利用Swiss-Model同源建模的方法预测这26个ZmFLAs蛋白的三级结构。从图2可以看出，三级结构主要是由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链等元件组成，其中ZmFLA1/2/3/7/13/17/22/23/24空间结构较为保守；ZmFLA8/12/14/16/18/19/25与这些蛋白类似，但是空间结构明显较为松散；其余ZmFLAs的结构则与上述蛋白存在明显差异，其中ZmFLA5/10/11/20结构较类似。

3结论与讨论

本研究通过多种数据库和在线软件，对玉米FLA蛋白基因家族进行了全面的鉴定和分析。结果显示，从玉米全基因组中共鉴定出了26个FLAs，对其理化性质的研究显示，大多数ZmFLAs都是疏水性氨基酸。亚细胞定位预测结果显示，绝大多数ZmFLAs定位在质膜上，这可能与FLAs参与细胞间信号转导有关[13]。系统进化分析结果显示，玉米、拟南芥FLAs被聚类在8个独立的进化分支中，每个进化分支中都有玉米、拟南芥FLAs蛋白的分布，暗示在单子叶、双子叶植物中，该家族成员可能拥有共同的祖先。但是，在每个进化分支中，不同物种来源的FLAs蛋白并没有呈现交叉分布，这说明该蛋白基因家族的扩张可能是发生在单子叶、双子叶植物进化之后，并且其扩张在单子叶、双子叶植物中是独立进行的。

目前认为，蛋白质的一级结构决定二级结构，二级结构又决定着三级结构，而蛋白质的功能往往取决于其空间结构。本研究对26个ZmFLAs的结构进行了分析。二级结构分析结果表明，ZmFLAs蛋白包含α-螺旋、无规则卷曲和延伸链等元件。其中无规则卷曲所占比例最高，α-螺旋次之，延伸链比例最低。同时，各个ZmFLAs中不同元件的比例和分布也存在差异。进一步的三级结构分析表明，尽管部分 ZmFLAs 的空间结构十分保守或者类似，但是其拓扑结构和聚合角度也存在明显差异，这暗示不同的ZmFLAs可能具有各自独特的功能。

已有关于FLAs的报道主要集中在双子叶模式植物拟南芥中，鲜见对单子叶经济作物中FLAs生物学功能的相关报道。本研究应用生物信息学的方法鉴定了玉米FLAs蛋白家族成员，并对FLAs的基本理化性质、亚细胞定位、系统进化、二级结构和三级结构等进行了详细分析，以期为深入探讨ZmFLAs的生物学功能提供理论基础。

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