艾滋病相关DLBCL中EB病毒的感染情况分析

高 波，孙晶晶，段月勋，邓 刚，杨 倩，王 霖，潘 云*

（1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.云南省第一人民医院，昆明 650100；3.云南省传染病专科医院，昆明 650301；4.昆明市第一人民医院，昆明 650000；5.昆明市传染病医院，昆明 650200）

艾滋病相关DLBCL中EB病毒的感染情况分析

高 波1，孙晶晶2，段月勋3，邓 刚1，杨 倩4，王 霖5，潘 云1*

（1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.云南省第一人民医院，昆明 650100；3.云南省传染病专科医院，昆明 650301；4.昆明市第一人民医院，昆明 650000；5.昆明市传染病医院，昆明 650200）

目的：分析艾滋病相关弥漫性大B细胞淋巴瘤（AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma，HIV-DLBCL）中EB病毒的感染状况，并探讨其在HIV-DLBCL中的作用。方法：收集20例HIV-DLBCL组织作为实验组，5例非HIV感染的DLBCL（non-HIV-DLBCL）、4例HIV阳性淋巴结反应性增生（HIV-reactive hyperplasia，HIV-RH）、5例HIV阴性RH（non-HIV-RH）均作为对照组。采用原位杂交的方法对EBER（EB病毒编码的小RNA）的表达情况进行检测。结果：HIV-DLBCL中EBER的总阳性率为30%（6/20）；non-HIV-DLBCL中EBER的阳性率为40%（2/5）；HIV-RH和non-HIV-RH中EBER均呈阴性。结论：EBV感染与部分DLBCL的发生有关，但EBV在HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中的作用是否具有差异还需进一步深入研究。

艾滋病相关弥漫性大B细胞淋巴瘤；EB病毒；EBER

获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Defi⁃ciency Syndrome，AIDS），即艾滋病，是指人体感染人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）后，造成机体免疫功能严重受损，发生机会性感染和恶性肿瘤等一系列临床表现的综合征。艾滋病相关淋巴瘤（AIDS-related lymphoma，ARL）是一组与HIV感染相关的异质性淋巴造血组织增殖性疾病，其本质为免疫细胞的恶变〔1〕。流行病学资料显示，与普通人群相比，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）的发病率在HIV阳性患者中显著升高，比非HIV感染者发生NHL的机率高60~200倍〔2-3〕。ARL已逐渐取代Kaposi肉瘤，成为最常见的AIDS相关恶性肿瘤〔4〕。ARL的常见病理类型以中度恶性的弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-celllymphoma，DLBCL）和高度恶性的伯基特淋巴瘤（Burkittlymphoma，BL）为主，约占95%以上，还有一些罕见的亚型〔5〕。

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是双链DNA病毒，基因组长172 kb，属于人类疱疹病毒科γ亚科，具有嗜人类淋巴细胞的特性〔6-7〕。EBV在全世界的感染率高达90%，大多数人终身潜伏感染，机体免疫功能明显下降等少数情况下，免疫系统和病毒之间的平衡失调，则可能引起恶性的淋巴细胞增殖性疾病。近年研究发现EB病毒与霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）、Burkitt淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤等关系密切，EBV阳性的淋巴瘤被称为EBV相关淋巴瘤〔8〕。张彦等〔9〕用EB病毒液在体外感染人外周血淋巴细胞，成功建立淋巴母细胞株，并发现EB病毒相关淋巴母细胞在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性。EBV潜伏感染时，其DNA整合于宿主细胞核内，不表达或部分低表达，当机体免疫功能低下时，EBV变异株再感染，使大量EBV-DNA克隆片段整合至宿主DNA上，促进宿主细胞异常增殖，最终导致癌变。在BL、DLBCL、PCNSL、KSHV（+）PEL等淋巴瘤中均有不同程度的EBV感染，感染率约为60%~100%〔10〕。EBV阳性淋巴瘤临床过程呈侵袭性，预后差〔11〕。

鉴于云南省为HIV感染的高发省份，探究ARL的发病机制十分必要，因此我们采用原位杂交的方法检测HIV-DLBCL组织中EBER（EBV编码的小RNA）的表达，探讨EBV感染与HIV-DLBCL的发生是否存在相关性。

1 材料与方法

1.1组织标本收集2008至2013年度云南省多家医院（大理大学附属医院、云南省传染病医院、昆明市传染病医院等）的艾滋病相关弥漫性大B细胞淋巴瘤（AIDS/HIV-related diffuse large B-cell lymphoma，HIV-DLBCL）手术或活检石蜡包埋标本20例。对照组14例石蜡包埋标本也收集自上述医院，分为3组，其中A组为5例非HIV感染的DLBCL（non-HIV-DLBCL），B组为4例HIV阳性淋巴结反应性增生（HIV-reactive hyperplasia，HIV-RH），C组为5例non-HIV-RH。20例HIV-DLBCL和5例non-HIV-DLBCL患者入院前均未进行治疗。按照2008年WHO关于淋巴造血组织肿瘤的分类标准，由大理大学附属医院病理科2名高年资病理医生对HE切片进行复核。

1.2主要试剂EBER原位杂交试剂盒购自福建泰普生物科学有限公司；苏木素、伊红购自美国Sigma公司；二甲苯、无水乙醇、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、甲醛等试剂均购自天津风船化学试剂科技有限公司。

1.3核酸原位杂交标本均以4μm连续切片，65℃恒温箱中烤片1 h，按照EBER原位杂交试剂盒的说明检测EB病毒小RNA。以PBS代替杂交液做阴性对照，选用EB病毒阳性的鼻咽癌组织切片作阳性对照。

1.4结果判读EBER原位杂交阳性表达定位于胞核，呈棕黄色细颗粒状，阳性细胞比例≥5%为阳性，<5%为阴性。胞质和胞膜着色视为阴性。

1.5统计学分析采用统计学SPSS 17.0软件对数据进行处理，对相关计数资料分析采用Fisher确切概率法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1临床资料分析20例HIV-DLBCL患者的临床特点：男性15例，女性5例，男：女比例为3：1；年龄范围29~66岁，中位年龄50岁，其中大于60岁者4例，占20%，小于等于60岁者16例，占80%，两者之比约为0.25：1；原发于结内者14例，占70%，原发于结外者6例，占30%，两者之比约2.3：1；其中结内原发于颈部淋巴结7例（7/14），腋窝淋巴结2例（2/14），腹股沟淋巴结者4例（4/14），其他部位淋巴结1例（14/14），结外原发于胃肠道5例（5/6），睾丸1例（1/6）；免疫分型：GCB型5例，占25%，nonGCB型15例，占75%；临床分期早期（Ⅰ+Ⅱ）者7例（7/20），占35%，进展期（Ⅲ+Ⅳ）13例（13/20），占65%，两者之比约为0.54：1。20例HIV抗体确认实验均呈阳性。

对照组14例，男性9例，女性5例，男：女比为1.8：1；年龄27~72岁，中位年龄47.5岁。对照组：A组5例non-HIV-DLBCL，淋巴结内病变3例（颈部、腋下及后腹膜等处淋巴结），结外病变2例（颌下及大腿根部等处肿物）；B组4例HIV-RH，均为颈部淋巴结病变组织；C组5例non-HIV-RH，颈部淋巴结病变组织4例，腹股沟淋巴结病变组织1例。

2.2 EBER在各组样本中的表达情况20例HIVDLBCL中EBER总阳性率为30%（6/20）。对照组14例样本中EBER总阳性率为14.29%（2/14），A组5例non-HIV-DLBCL中EBER阳性率为40%（2/5），B组4例HIV-RH和C组5例non-HIV-RH中EBER均呈阴性。HIV-DLBCL与non-HIV-DLBCL中EBER的表达率明显高于HIV-RH和non-HIV-RH，表明EBV感染与部分DLBCL的发生有关。见表1、图1。

表1 EBER在各组样本中的表达情况

图1 免疫组化法检测HIV-DLBCL中EBER阳性表达（核阳性）400x

EBER在HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中均有表达，但表达率较低，两组肿瘤中EBER总阳性率为32%。HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中EBER表达率差异无统计学意义（P=1.000）。见表2。

何万贯（2007）认为，写作是一个过程，包含第一写作过程和第二写作过程。前者指学生收到写作任务，完成后上交作文的过程；后者指学生收到批改过的作文并根据评语修改的过程。在第二写作过程中，学生要分析并理解评语和反馈信息，重新组织与修改作文。这是一项高级认知活动，对提高作文质量至关重要（何万贯，2007）。

表2 HIV/non-HIV-DLBCL组间EBER表达情况

3 讨论

DLBCL是临床特点、组织形态、免疫表型及分子遗传学特征具有多样性的侵袭性淋巴瘤，其分子发病机制错综复杂。与non-HIV-DLBCL相比，HIV-DLBCL在临床上表现出更强的侵袭性。HIV感染有关的淋巴瘤更倾向于复杂的淋巴结外病变，部分ARL患者出现一些特殊部位的侵犯，如肺、口腔、肾上腺、肾脏、心脏、胆囊、耳垂及其他淋巴瘤可涉及的复杂部位都有报道〔12〕。

EBV的致癌机制仍未完全阐明，目前研究认为可能与以下几点有关：①EBV对被其感染的B细胞有很强的转化能力或永生化能力；②某些相关因素，如特异性免疫识别或免疫监视功能丧失、其他病原体感染激活B细胞异常增殖以及与环境因素等协同作用；③EBV转化的B细胞出现继发性基因突变或染色体易位等变化〔13〕。EBV在不同研究中表达率存在差异，卢璐等〔6〕发现EBER1在DLBCL中的阳性率为25.0%。孙文文等〔7〕对EBV Lmp-1蛋白与EBER1 mRNA在DLBCL中的阳性率仅为0.94%、5.7%。Castillo等〔14〕认为EBV阳性的DLBCL患者应该按照类似EBV阴性DLBCL患者的指导标准进行分期和管理，经化疗免疫治疗后，EBV阳性患者的预后更差。Tisi等〔15〕对218例DLBCL患者的全血样本进行分析，在25%的患者全血中检测到EBVDNA，EBV阳性患者经R-CHOP免疫化疗后，无进展生存期和总生存期都明显短于EBV阴性的患者。

AIDS相关淋巴组织增殖性疾病是一组出现在HIV感染伴随免疫抑制状态下的疾病，受EBV感染的淋巴细胞可以发生无限制的增殖。Martorelli等〔16〕证实HIV-1基质蛋白p17由被感染的细胞释放并在淋巴组织中积累，可以与细胞受体CXCR1和CXCR2结合，B淋巴细胞中EBV感染或EBV LMP-1异位表达均可以上调CXCR2，增强细胞对p17结合和内化作用，同时在免疫缺陷群体中p17对EBV诱导的淋巴瘤发生具有促进作用。在30%~70%的HIV相关淋巴瘤病例中，可以检测到EBV基因组，并且两者的关系程度与淋巴瘤的组织病理类型相关〔17-18〕。PCNSL、免疫母细胞性（DLBCL）、PEL及其变异型、口腔PBLs等，均呈现EBV感染的特征〔2〕。

本研究结果与多数报道一致：EBV在HIVDLBCL中的表达率为30%，在non-HIV-DLBCL中的表达率为40%，与淋巴结良性病变组织中EBER的表达率具有明显差异，提示EBV感染可能参与部分HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL的发生。但由于本研究中病例样本量较小，尚未发现EBV在HIV-DLBCL与non-HIV-DLBCL发生机制中有意义的差异性。EBV因其对人类的普遍易感性、感染的潜伏性以及强烈的致癌性而对人类健康构成巨大威胁，EBV疫苗的使用或抗EBV治疗对预防和治疗淋巴瘤有积极的作用，因此分析淋巴瘤中EBV的感染情况具有重要意义。综上所述，我们将在后续研究中扩大样本量，进一步深入探讨EBV在HIVDLBCL和non-HIV-DLBCL发病机制中的作用。

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Analysis on Epstein-Barr Virus Infection in AIDS-related Diffuse Large B-cell Lymphoma

Gao Bo1,Sun Jingjing2,Duan Yuexun3,Deng Gang1,Yang Qian4,Wang Lin5,Pan Yun1*
（1.College of Clinical Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.The First People's Hospitalof Yunnan Province, Kunming 650100,China;3.Infectious Diseases Hospitalof Yunnan Province,Kunming 650301,China;4.The First People's Hospital of Kunming,Kunming 650000,China;5.Infectious Diseases Hospitalof Kunming,Kunming 650200,China）

Objective:To analyze the Epstein-Barr Virus（EBV）infection and discuss the role of EBV in AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma（HIV-DLBCL）.Methods:20 cases of HIV-DLBCL were collected as experimentgroup.5 cases ofnon-HIVDLBCL,4 cases of HIV-reactive hyperplasia（HIV-RH）and 5 cases ofnon-HIV-RH were collected as control group.The expression of EBER（EBV-encoded RNA）was detected by in-situ nucleic acid hybridization.Results:The total positive expression rate of EBER in HIV-DLBCL and in non-HIV-DLBCL was 30%（6/20）and 40%（2/5）,respectively.EBER was negative in both HIV-RH and non-HIV-RH.Conclusion:EBV infection was involved in tumorigenesis of part of DLBCLs,butitneeds to be further studied on whether EBV functions differently in HIV-DLBCL and non-HIV-DLBCL or not.

AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma;Epstein-Barr Virus;EBER

R733.4

A

2096-2266（2017）04-0059-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.016

（责任编辑 董 杰）

国家自然科学基金资助项目（81660037）；云南省高校病理学科技创新团队计划支持项目（云教科〔2014〕22号）；云南省临床重点专科建设基金资助项目（云财社〔2012〕311号）

2016-05-25

高波，助理实验师，主要从事分子病理学研究.

*通信作者：潘云，教授．